免疫力低下小鼠动物模型建立及快速检测研究

田嘉军，黄聘和，岳茜岚，何其励

(四川省疾病预防控制中心，成都 610041)

在市售提高免疫力功能的保健食品中，绝大部分产品提及适用人群是免疫力低下的人群，然而在《保健食品检验与评价技术规范》(以下简称《规范》)中，保健食品中的增强免疫力功能试验只设了阴性对照组动物，建议必要时设阳性对照组。阴性对照组动物只需蒸馏水灌胃，不做其他处理，我们可以理解为正常免疫力功能的动物。这样往往与检测样品的最终目的不同，因为有许多保健食品的保健功能是针对免疫力低下的人群。因此，免疫力低下小鼠动物模型的建立，将阳性对照加入到试验设计中，阳性对照组动物就是免疫力低下动物组，相对于正常免疫力动物组，对完善增强免疫力功能检验试验具有重大意义，这一动物模型的建立，对以后《规范》里增强免疫力功能检验试验是否添加阳性对照积累原始实验数据。

怎样制造动物免疫力低下、怎样快速验证动物模型成立，这是本文的目的。但在《规范》根本没有涉及这些方面的内容，免疫力低下动物摸型和评判指标也没有标准可查。因此，本研究通过四种处理方法，对比寻找出快速有效建立免疫力低下的小鼠动物模型，并筛选部分检测指标快速确定动物模型是否成立。提出简单可靠的检测指标，也是本研究的创新点之一。

1 材料和方法

1.1 实验动物

由四川省中医药科学院实验动物中心提供的KM小鼠，6～8周龄100只，全雌，体重18～22 g，SPF级，[SCXK(川)2018-19]；实验动物房为屏障系统，[SYXK(川)2016-043]。温度20℃～25℃，相对湿度40%～70%。本研究所有动物试验，严格按照“实验动物饲养管理和使用指南”进行，过程中按实验动物使用的3R原则给与人道关怀，并经四川省疾病预防控制中心实验动物伦理委员会批准(SCCDCDWLL2017007)。

1.2 主要试剂与仪器

环磷酰胺：江苏盛迪医药有限公司生产，批号：16112625。氢化可的松：武汉福鑫化工有限公司生产，批号：170823。无水乙醇：成都金山化学试剂有限公司，批号：20170426。小鼠免疫球蛋白A、G、M ELISA检测试剂盒:均由深圳子科生物科技有限公司生产，批号均为：201709。流式细胞仪(BD_FACSCalibur，贝克曼公司，美国)。全自动血液分析仪(SYSMEX XT-2000i型，奥林巴斯公司，日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

将100只全雌KM小鼠随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组五个组，各组20只；每组又分成A、B两部分，每部分为10只。

1.3.2 动物给药途径及剂量

Ⅰ组：环磷酰胺经口灌胃，剂量为100 mg/kg[1-3]，连续3 d；Ⅱ组：氢化可的松经口灌胃，剂量为80 mg/kg[4-6]，连续3 d；Ⅲ组：60%乙醇溶液经口灌胃，剂量为20 mL/kg，连续3 d；Ⅳ组：UVA紫外线皮肤照射(长波)，剂量为10 J/cm2，连续3 d，照射时间=(10 000 mJ/cm2)÷光强度；Ⅴ组：蒸馏水经口灌胃，剂量为20 mL/Kg，连续3 d。

1.3.3 小鼠实验前后体重对比

实验动物引进动物房观察3 d后，小鼠无异常，称量各试验组小鼠体重，然后连续3 d给药或处理，第4天取血前小鼠称重[7-8]。

1.3.4 小鼠血清免疫球蛋白含量测定

在第4天结束实验后，各组A部分动物取小鼠血至小玻璃试管中，水浴37℃，1 h，离心3000 r/min，5 min，取上层血清备用。用免疫球蛋白检测试剂盒测定各组小鼠血清中IGG、IGA、IGM的含量。

1.3.5 小鼠外周血测定

第4天结束实验后，各组B部分小鼠取血至含抗凝剂的小玻璃试管中，充分摇匀，制备抗凝血备用。用全自动血液分析仪测定小鼠外周血血常规指标。用BD_FACSCalibur流式细胞仪测定小鼠全血中B淋巴细胞CD19、T淋巴细胞CD3的含量，并观察CD19/CD3的比值情况[9-12]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠实验前后体重称量结果

实验动物引进动物房观察3 d后，进行完全随机分组，称量实验前及实验结束后体重。从表1可见，环磷酰胺组(Ⅰ组)、氢化可的松(Ⅱ组)和60%乙醇溶液组(Ⅲ组)体重均较对照组(Ⅴ组)有明显差异。特别是60%乙醇溶液组(Ⅲ组)小鼠，体重还有下降的趋势，体重均值比实验前还低，3 d高浓度的乙醇连续灌胃，可能导致动物机体功能损伤。环磷酰胺组(Ⅰ组)和氢化可的松(Ⅱ组)由于药物作用，实验动物生长缓慢，动物机体功能有一定的影响。紫外线皮肤照射组(Ⅳ组)体重基本没有受到影响，估计在此强度下的紫外线照射对实验小鼠对机体损伤不大。

2.2 小鼠血清免疫球蛋白含量测定结果

按照小鼠免疫球蛋白检测试剂盒的要求加入待检血清样10 μL,根据试剂盒提供的标准品测量得到的OD值绘制标准品工作曲线，将各组待测血清测得的OD值按曲线方程计算各样本浓度值。从表2可见，环磷酰胺组(Ⅰ组)和60%乙醇溶液组(Ⅲ组)小鼠血清IGG、IGA、IGM的含量较对照组有明显下降。氢化可的松(Ⅱ组)小鼠血清IGG和IGA含量亦有下降，提示机体免疫能力有下降。紫外线皮肤照射组(Ⅳ组)三者测量值与对照组(Ⅴ组)比较未见有统计学上的差异。

2.3 小鼠外周抗凝血血常规测定结果

选取白细胞数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值7个血常规指标作为观察对象。环磷酰胺组(Ⅰ组)的白细胞数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值6个指标与对照组(Ⅴ组)比较有统计学上的差异；氢化可的松(Ⅱ组)的淋巴细胞百分比、淋巴细胞绝对值2个指标与对照组(Ⅴ组)比较有统计学上的差异；60%乙醇溶液组(Ⅲ组)的白细胞数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、淋巴细胞绝对值4个指标与对照组(Ⅴ组)比较有统计学上的差异；紫外线皮肤照射组(Ⅳ组)的淋巴细胞百分比、淋巴细胞绝对值2个指标与对照组(Ⅴ组)比较有统计学上的差异。其余各组各项指标与对照组(Ⅴ组)比较未见有统计学上的差异(见表3)。

表1 小鼠试验前后体重

注：与Ⅴ组(空白对照组)比较,aP<0.01。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01.

表2 小鼠血清免疫球蛋白含量

注：与Ⅴ组(空白对照组)比较,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

表3 小鼠实验后血常规各项指标

注：与Ⅴ组(空白对照组)比较,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

2.4 小鼠外周抗凝血B淋巴细胞CD19、T淋巴细胞CD3含量测定结果

环磷酰胺组(Ⅰ组)的B淋巴细胞CD19、T淋巴细胞CD3含量有明显下降，远远小于对照组(见图1)；氢化可的松(Ⅱ组)的B淋巴细胞CD19含量有减少，CD19/CD3比值与对照组(Ⅴ组)比较有统计学上的差异；60%乙醇溶液组(Ⅲ组)和紫外线皮肤照射组(Ⅳ组)与对照组(Ⅴ组)比较均未见有统计学上的差异(见表4)。

图1 淋巴细胞计数图Figure 1 Lymphocytes counting map

组别GroupB淋巴细胞CD19含量B-Lymphocyte CD19 contentT淋巴细胞CD3含量T-Lymphocyte CD3 contentCD19/CD3比值CD19/CD3 ratioⅠ组(Ⅰ Group)72±42.5a839±304.8a0.086±0.042aⅡ组(Ⅱ Group)1482±318.1b1874±364.40.824±0.260bⅢ组(Ⅲ Group)1553±1012.31790±503.10.809±0.376Ⅳ组(Ⅳ Group)2103±552.52203±626.31.019±0.338Ⅴ组(Ⅴ Group)2955±1039.12321±687.81.292±0.380

注：与Ⅴ组(空白对照组)比较,aP<0.01,bP<0.05。

Note. Compared with the Ⅴ Group(control group),aP<0.01,bP<0.05.

3 讨论

在免疫毒理学中常见的阳性物有地塞米松、氢化可的松、环磷酰胺等。这些阳性物能造成动物的免疫抑制。在众多的相关文献中，我们发现用环磷酰胺建立免疫力低下的动物模型，可以通过各种方式达到。邓少嫦等[13]用剂量100 mg/kg的环磷酰胺3 d连续腹腔注射，郭静等[14]用剂量为50 mg/kg的环磷酰胺4 d连续腹腔注射，张芮琪等[15]则用剂量为75 mg/kg的环磷酰胺隔天分3次腹腔注射，高敏等[16]还用偏最小二乘法(PLS)数学建模分析不同剂量环磷酰胺建立模型的情况，可以看出，以往的研究大多是以腹腔注射为给药途径，而为了与试验组给药途径一致，本研究建立以灌胃为给药途径，连续3 d 100 mg/kg剂量的环磷酰胺，也可致KM小鼠免疫力低下模型成立。用本实验条件下的环磷酰胺试验组可引起KM小鼠体重明显下降，小鼠血清免疫球蛋白含量(包括IGG、JGM、IGM)显著下降，血常规指标白细胞数、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比等指标都出现异常，小鼠外周血B淋巴细胞CD19、T淋巴细胞CD3含量显著下降。由结果可得，环磷酰胺具有明显的免疫抑制作用，选择其作为保健食品增强免疫力功能评价实验免疫力低下模型建立的阳性物是适宜的，动物模型在此条件下成立。

本实验条件下的氢化可的松实验组制造免疫力低下的动物模型某些指标没有环磷酰胺实验组理想，如血清免疫球蛋白IGM含量没有显著性差异、白细胞和单核细胞百分比没有显著性差异、外周血T淋巴细胞浓度亦没有显著性差异。氢化可的松可以建立小鼠免疫力低下的模型国内外很多研究已证明，大多为5次肌肉注射氢化可的松40 mg/(kg·BW)，本实验条件为经口灌胃3 d 80 mg/(kg·BW)氢化可的松，可能在该实验条件下，没有肌注给药途径理想，但为了保持和实验研究对象保持相同的给药途径，我们还是想优先考虑相同途径，至于经口氢化可的松如何能达到理想的动物模型，有待我们进一步的研究。

本实验条件下60%乙醇溶液组虽然能造成血清免疫球蛋白IGG、IGA、IGM含量显著性下降，但造成动物体重显著下降，对机体产生了严重的损害，不适宜作为免疫抑制的阳性物，至于用15%乙醇溶液灌胃30 d，这是含酒精产品做阴性对照组的灌胃条件，这样是否会造成小鼠免疫力低下，需进一步研究。

本实验条件下紫外线皮肤照射组没有得出的满意的结果，估计是紫外线照射剂量不合适，本实验照射剂量是参考豚鼠皮肤光毒实验剂量，在此剂量下豚鼠可以造成皮肤伤害，可能是豚鼠和小鼠存在种间差异的缘故。王丽英等提出紫外线对免疫系统的影响可能有双重作用[17-22]，亦有可能诱发机体免疫抑制，又有可能诱导机体免疫保护，并对此种差异的产生列举了4种不同因素有关，故紫外线对免疫系统的影响在学术界依然存在着很大的争议。

因此，连续经口灌胃环磷酰胺(100 mg/kg)3 d，建立的KM小鼠免疫力低下的动物模型是成立的，是本实验室首选条件。这一实验条件的建立和实验证明是建立免疫力低下小鼠动物模型的创新，在其他文献资料中鲜见。

如何检测免疫抑制动物模型成立，方法有很多，常见的有：脏器指数，血常规及生化指标，血清免疫球蛋白含量，NK活性细胞测定，碳廓清实验，抗体生成细胞检测，脾淋巴细胞转化实验等等，从各种检测指标简便容易程度上来看，体重、血清免疫球蛋白含量、血常规这三个指标简单易得，检测成本低廉且时间周期短，检出有效率高。而外周血B淋巴细胞CD19、T淋巴细胞CD3含量的检测费用高，检测时间长，但测出的数值可靠性强[23-25]。本次研究这四种指标都相互验证了实验结果的可靠性，作为日常检测工作的动物模型建立确认的指标，本研究推荐动物体重、血清免疫球蛋白含量、血常规三项易得的指标。推荐的这三项指标，亦是本研究大胆开创性的尝试，期望在以后更多的实践工作中同行能用实验验证与改进。