高通量氙光传递窗与紫外传递窗灭菌效果观察

许 琦，赵 月，黄伟健，宋琳亮，康 生，刘 毅，和 君*，傅江南*

(1.暨南大学实验动物管理中心，广州 510632； 2.西安富康空气净化设备工程有限公司 西安 710000)

传递窗作为实验动物屏障设施内物品传递的通道上的一种重要杀菌设备，主要用于洁净区与非洁净区、洁净区与洁净区之间物品的传递，以避免其受到环境的污染。常用的传递窗是利用紫外线(波长在225～275 nm，峰值253.7 nm)照射，产生能量传递和积累而达到破坏微生物核酸的目的[1]。紫外传递窗杀菌效果与紫外线的输出能量、灯的类型、光的强度和使用时间有关。一旦紫外灯管老化，它将丧失30%～50%的光照强度，杀菌能力大打折扣[2]。为此，我国国家标准GB19258《紫外线杀菌灯》指出紫外灯杀菌最佳时间为30 min[3-4]。但在实际应用中，尤其是在人流、物流量大的科研中心或动物中心，使用30 min的照射时间，将很大程度上限制屏障环境的进出效率，影响工作效率。针对紫外灯传递窗灭菌效果受多种因素影响且耗时长的问题，本研究关注一种新型高通量氙光传递窗，它利用脉冲氙灯极化发光的原理，通过产生强烈的脉冲紫外光线，可快速对物品表面和空气中的各类微生物进行灭活[5]。本研究针对细菌繁殖体(金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌)[6-8]、细菌休眠体(枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢体)[9]、真菌(白色念珠菌)[10]这3种微生物形态的5种标准菌株经传递窗不同时间点的照射，通过与传统紫外传递窗的杀菌效果进行对比分析，从而得到杀菌效果的评价。

1 材料和方法

1.1 实验材料

菌种：金黄色葡萄球菌(简称金葡，ATCC6538)、绿脓杆菌(简称绿脓，ATCC15442)、大肠杆菌(简称大肠，ATCC8099)、白色念珠菌(简称白念，ATCC10231)均购自广东环凯微生物有限公司；枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢菌片(简称枯草ATCC9372)购自北京鑫四环消毒技术开发有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

脑心浸液培养基BHI(海博生物技术有限公司)；营养琼脂胰蛋白胨大豆琼脂TSA(海博生物技术有限公司)；马铃薯葡萄糖琼脂PDA(环凯生物科技有限公司)；营养琼脂NA(环凯生物科技有限公司)；TSB(海博生物技术有限公司)；胰蛋白胨生理盐水溶液(TPS)由本实验室制备。生物梅里埃公司DENSIMAT细菌浊度仪，MX-F涡旋仪，日本三洋MIR-262恒温培养箱，传统紫外传递窗(UVPB)，高90 cm×宽80 cm×长60 cm，配置20 W紫外线消毒灯6支，每支灯管平均辐照度为75.01 μW/cm2。FX-XB-D800高通量氙光传递窗(XePB)，高90 cm×宽82 cm×长88 cm(西安某公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 菌悬液的制备

按照卫生部法监发[2002] 282 号[11]，复苏菌种后，菌种培养至第四代(不同菌种的培养时间及温度有所不同，详见所购菌种的微生物检测冻干质控菌种使用说明书)，挑取菌落接入5 mL TSB营养肉汤中，涡旋仪涡旋震荡20 s，制成菌悬液备用，枯草芽孢杆菌本身即为黑色变种芽孢菌片，直接洗脱制成芽孢悬液。为便于活菌计数，细菌浊度仪读取菌悬液浓度：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌菌悬液浓度取0.7～1.4 Mcf(麦氏浊度)；白色念珠菌菌悬液浓度取6.9 Mcf。

1.3.2 菌片的制备

滴片法，将灭菌后的10 mm×10 mm玻片平铺于无菌平皿，逐片滴加10 μL菌液，自然风干后制成菌片。

1.3.3 传递窗杀菌检测

将菌片平置于无菌平皿中，盖上编号，平板放置数量参考医药工业洁净室区沉降菌的测试方法中的相关规定[12]，传递窗内中线左右各三分之一处分别放入1皿，高通量氙光传递窗照射时间设定1 min、3 min、5 min；传统紫外传递窗设定照射时间设定5 min、30 min进行检测。

1.3.4 洗脱培养

照射后将菌片加入5 mL TPS中涡旋洗脱，取1 mL洗脱液于无菌培养皿，同时每皿倒入50℃，15 mL配置好的TSA培养基，白色念珠菌需倒入PDA培养基，凝固后，按各菌种适宜的培养条件分别进行培养。为防止菌落数过多不便于活菌计数，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌阳性菌片洗脱液需按照10-4与10-5比例稀释后倒板；白色念珠菌阳性菌片洗脱液10-3与10-4稀释后倒板；枯草芽孢杆菌阳性菌片洗脱液10-1与10-2稀释后倒板。

1.3.5 活菌计数

阳性平板菌落数乘以稀释倍数，即得到每毫升洗脱液中细菌数量(N0)。实验组进行活菌计数，平皿长菌数为对应样每毫升洗脱液中细菌数∶

杀菌率=(N0-NX)/N0×100%

式中：N0为每毫升洗脱液中细菌数量，NX为照射后每毫升菌片洗脱液中活菌个数。每组重复3次，取平均杀菌率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 细菌繁殖体的抑菌率

紫外传递窗灯管为6根环绕式，其到菌片的直线距离分别为30 cm、52 cm和60 cm，均在表面消毒的有效范围内[13]，因此本研究不单列不同的距离对杀菌效果的影响。此外，为对传递窗杀菌效率进行比较，高通量氙光传递窗的建议工作时长1 min、3 min、5 min，特选紫外传递窗的时长为5 min及最佳工作时长30 min进行比较。高通量氙光传递窗照射1～5 min对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及绿脓杆菌的平均杀菌率均可达99.99%以上。紫外传递窗照射5 min对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无明显杀灭效果；照射30 min对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌方可达到高通量氙光传递窗照射1 min的杀菌率；照射30 min对大肠杆菌杀灭率达99.91%。

具体数据见表1、图1、图2。

2.2 照射对细菌休眠体的杀灭情况

高通量氙光传递窗照射1 min对枯草芽孢杆菌的杀菌率达99.96%，照射3 min、5 min可达100.00%。紫外传递窗照射5 min对枯草芽孢杆菌的杀灭率仅为45.20%，照射30 min杀菌率大于99.99%具体数据见表2、图3。

2.3 照射对真菌的杀灭情况

高通量氙光传递窗照射1 min、3 min对白色念珠菌的平均杀菌率达99.97%，照射5 min杀菌率可达100.00%。紫外传递窗照射5 min对白色念珠菌无明显杀灭效果，照射30 min杀菌率达100.00%。具体数据见表3、图4。

表1 高通量氙光传递窗与紫外传递窗对3种细菌繁殖体的杀灭情况

注：独立重复3次实验，测试样品n=6，阳性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

注：A：金黄色葡萄球菌；B：大肠杆菌；C：绿脓杆菌；阳性对照：阳性洗脱液稀释后铺板，培养48 h。图1 紫外传递窗和高通量氙光传递窗在不同照射时间点对金葡、大肠、绿脓的悬液涂布照射结果Note. A, Staphylococcus aureus. B, Escherichia coli. C, Pseudomonas aeruginosa. Positive control, The positive eluent was cultured 48 h after dilution.Figure 1 Result of radiation of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa at different time points

注：A、B、C：高通量氙光传递窗(XePB)照射1 min、3 min、5 min,紫外传递窗(UVPB)照射30 min后金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌菌片洗脱液的含菌数。**P<0.01；****P<0.0001。图2 紫外传递窗和高通量氙光传递窗在不同照射时间点对金葡、大肠、绿脓的差异分析Note. A,B,C, The number of bacteria in the eluent of staphylococcus aureus, escherichia coli and pseudomonas aeruginosa after 1, 3 and 5 min of high-throughput xenon light pass box irradiation and 30 min of uv light pass box irradiationFigure 2 Difference analysis of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa at different time points

表2 高通量氙光传递窗与传统紫外传递窗对枯草芽孢杆菌的杀灭情况

注：独立重复3次实验，测试样品n=6，阳性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

注：A：悬液涂布照射结果；阳性对照：阳性洗脱液稀释后铺板，培养72 h；B：差异分析。图3 紫外传递窗和高通量氙光传递窗在不同照射时间点对枯草芽孢的杀灭情况Note. A, Result of radiation. Positive control, The positive eluent was cultured 72 h after dilution.B, Difference analysis.Figure 3 Result of radiation of High-throughput Xenon Ray Pass Box and ultraviolet Pass Box on Bacillus subtilis at different time points.

真菌Fungus高通量氙气传递窗XePB紫外传递窗UVPB照射时间Exposure time 菌落数 Colony forming units杀菌率 Sterilizingrate照射时间Exposure time 菌落数 Colony forming units杀菌率 Sterilizing rate菌株浓度(CFU/mL)白色念珠菌Candida albicans1 min0.67±0.823 min0.67±0.525 min0 99.97%100% 5 min>300-30 min0100%3×103

注：独立重复3次实验，测试样品n=6，阳性菌株n=4。

Note. Repeat 3 experiments independently. Testing samplen=6, Positive strainn=4.

3 讨论

洁净环境是确保无菌产品生产的重要影响因素[14]，传递窗作为屏障设施内的一种常用的辅助设备，能最大限度的降低洁净区的污染[5]，对解决各种生物安全问题起到不可忽视的重要作用。紫外灯消毒杀菌是物体表面消毒的常用方法，此法经济、实惠、方便。但其最佳消毒时间一般为30 min，如果大量实验人员要进入洁净区，往往需要等待较长时间，有时甚至个别实验人员在未彻底杀菌后就将传递窗内的物品传入洁净区，增加了洁净区病原微生物感染的风险，同时也对实验人员和环境造成威胁。本文通过对紫外传递窗和高通量氙光传递窗对5种病原的不同照射时间对杀灭效果的影响进行实验，探讨不同类型传递窗的杀菌效果。

本文选取的5种菌株分别是金黄色葡萄球菌，它是细菌繁殖体中化脓菌的代表[6]；绿脓杆菌，是医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表[7]；大肠杆菌，是细菌繁殖体中肠道菌的代表[8]；白色念珠菌，是空气中真菌的代表[9]；枯草芽孢杆菌，是黑色变种芽孢为细菌休眠体的代表[10]，这5种菌是实验动物中心的常见菌，也是《消毒产品消毒效果检验技术规范》里规定检测灭菌效果的必备菌株，绿脓杆菌与金黄色葡萄球菌更是CL级以上动物的常见污染菌[15]。紫外传递窗照射5 min对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌无明显杀灭效果，对绿脓杆菌的杀灭率仅为45.20%，不同菌种间的差异大，对紫外光敏感度高的菌体短时间内被杀灭率较高[16]，照射30 min对5种菌杀菌率达99.91%以上。高通量氙光传递窗1 min能对5种菌造成 99.85% 以上的杀菌率，5 min杀菌率可达 100%，效果明显好于传统的紫外传递窗，且具有高效的特点。在人员流动性大、物品传递频繁的动物中心，实验动物的生存环境条件稳定与否将会直接决定着动物实验数据的质量[17]，高通量氙光传递窗不仅为物品传递和人员进出节省了时间，降低了洁净区的感染风险。此外，采用的氙气为惰性气体，不含汞，不污染环境。脉冲氙灯的寿命约为500 h[5]、激光光束质量好、稳定等优点(寿命期内其光谱能量分布几乎不变[18-20])，需注意的是高通量氙光灯工作的频闪阶段应避免直视传递窗[18]。

高通量氙光传递窗利用高压氙气短时间内 (10～100 ms) 产生紫外线脉冲的原理，较传统紫外传递窗汞原子激发释放紫外光，通过各方面对比，其高效的杀菌能力，有望替代紫外传递窗，可更好的保障屏障环境、隔离污染，实现洁净区的高效运作。