新鲜山药提取物对小鼠胃溃疡的预防作用研究

金佳熹，周冰玉，李柳蓉，冯青秀，柯春娇，覃海音，农雪娟，赵 爽

(右江民族医学院，广西 百色 533000)

胃溃疡(gastric ulcer，GU)是一种临床常见的消化道疾病，患病率可达10%左右，主要症状为上腹疼痛、多表现为剑突下痛、呈隐痛、钝痛、胀痛、烧灼痛，更是具有1%～3%的癌变率，临床治疗困难且患者个人十分痛苦[1]。“山药”是薯蓣的块茎，祖国四大怀药之一，目前认为山药中的有效成分多糖是其主要活性成分并存在于山药黏液质中[2-5]。近年研究显示，山药可促进细胞免疫和体液免疫系统发挥作用，影响胃肠动力学，还可抗衰老及降血糖等。本研究通过计算新鲜山药提取物对胃溃疡小鼠溃疡指数、观察黏膜形态结构，及测量血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)表达的变化，探究新鲜山药提取物在防治胃溃疡过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通级KM小鼠100只，9周龄，右江民族医学院动物实验中心买进[SCXK(桂)2017-0003]，小鼠体质量25～30 g，雌雄各半。动物饲养于动物实验房，室温22℃～24℃，相对湿度50%～70%，光线为12 h明暗循环。使用小鼠标准饲料喂养，自由饮水。小鼠的血液取材等实验操作在右江民族医学院机能实验中心[SYXK(桂)2018-0006]。完成。本实验所涉及的所有动物实验均已经右江民族医学院伦理委员会审核批准(伦理审查证号2017050101)，严格执行实验动物安全等相关规定。严格遵守动物使用的3R原则，实验整个过程均给予实验小鼠以人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

消炎痛(购自Sigma公司)；新鲜山药(购自菜市)；施维舒胶囊(购自苏州卫材制药有限公司)；血清MDA(批号：20171019)、NO(批号：20171019)、SOD(批号：20180511)和GSH-Px(批号：20180511)活性检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)；其余生物与生化试剂分析纯(购自国药集团化学试剂有限公司)；UV-1700紫外可见分光光度计(购自上海精密科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 鲜山药提取物制备

挑选粗细长短相同、横切面雪白色、外皮无损伤的新鲜瘦长山药为原料。将山药洗净、去皮并切成大小均等的小块。用大功率食品打浆机打浆。实验高剂量组为鲜山药匀浆加1/3倍体积双蒸水，实验低剂量组为鲜山药匀浆加3倍体积双蒸水，相当于高剂量组浓度为0.75 g/mL，低剂量组的浓度为0.25 g/mL。将配备好的山药匀浆充分搅拌用于灌胃。

1.3.2 动物分组和模型制备

全部实验用小鼠随机分成5组：空白对照组、模型组、施维舒组、鲜山药提取物高剂量组、鲜山药提取物低剂量组，每组20只，雌雄各半。用消炎痛一次灌胃法，化学点燃小鼠急性胃溃疡模型。空白对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，施维舒组灌胃浓度为2.0 mg/mL施维舒溶液，鲜山药提取物高剂量组、低剂量组分别灌胃浓度为0.75 g/mL、0.25 g/mL鲜山药提取物，灌胃量为10 mL/kg体重。每只每日灌胃1次，连续灌胃45 d。之后对除空白对照组外的其他4组用消炎痛(2.5 mg/mL)进行一次性灌胃建立胃溃疡模型，7 h后处死全部小鼠。取血检测血清SOD、GSH-Px活性及NO、MDA蛋白表达。

1.3.3 胃溃疡指数测定及溃疡抑制率计算

解剖小鼠取胃组织，沿胃大弯全部剪开，用生理盐水漂洗胃组织内部黏膜，之后将其平铺滤纸上吸干水分，最后展平在固定板上用细针头沿边缘固定，观察溃疡的情况。采用Guth标准计算溃疡指数(溃疡面积)：病变的最大径<1 mm为1分；1～2 mm为2分；2～4 mm为3分；>4 mm为4分；若病灶宽于2 mm，其长度乘以2。每只小鼠的溃疡指数为此小鼠全胃出现总病灶之和的评分。胃溃疡抑制率=[(模型组大鼠胃溃疡指数-给药组大鼠胃溃疡指数)/模型组大鼠胃溃疡指数]×100%。

1.3.4 胃黏膜组织HE染色

于福尔马林中固定完成后进行石蜡包埋，对胃组织溃疡面进行组织病理切片，厚度4 μm，脱蜡，苏木精-伊红(HE)染色，在显微镜放大100倍视野下观察其细胞和组织的形态结构变化。它是现阶段临床医学领域一种重要的诊断方法，对疾病的后续治疗方案构建提供了重要依据，是疾病诊断金标准。

1.3.5 检测血清SOD、GSH-Px活性及NO、MDA蛋白表达

动物处死后取小鼠血液静置，4℃下以离心半径13.5 cm、4000 r/min离心10 min，取上清液。检测SOD含量(黄嘌呤氧化法)，检测GSH-Px活性(硫代巴比妥酸法)，检测NO、MDA含量(紫外分光光度法)，所有实验检测步骤严格按试剂盒说明书进行。

表1 各组胃溃疡指数和溃疡抑制率比较

注：与空白对照组比较，＊P<0.01；与模型组比较，#P<0.05；与施维舒阳性组比，**P<0.05，下表同。

Note. Compared with the control group,＊P<0.01. Compared with the Model group,#P<0.05. Compared with the Selbex see teprenone group,**P<0.05. The same in the following tables.

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 测定胃溃疡指数、计算溃疡抑制率

空白对照组大鼠的胃黏膜肉眼观察见表面光滑，淡粉色，有黏膜皱襞，无充血、出血现象。模型组小鼠胃腔黏膜表面有弥漫性水肿，内表面出现咖啡样物质，经生理盐水缓慢冲洗后见广泛分布的出血点及条索状、点状深褐色溃疡，胃体胃溃疡指数达到(5.73±1.83) mm2，胃溃疡动物模型点燃成功。如图1～图2。经过施维舒阳性药物处理后可显著减轻胃溃疡，病变溃疡指数仅为(1.27±0.38) mm2。新鲜山药提取物预防给药可使小鼠胃溃疡面积降低(P<0.05)，其中高浓度山药提取物组胃溃疡抑制率接近阳性药施维舒组。结果见表1。

图1 正常对照组胃黏膜内壁Figure 1 Inner wall of the gastric mucosa in the normal control group

注：箭头所示为溃疡出血。图2 溃疡模型组胃黏膜内壁Note. The arrow indicates ulcerative hemorrhaging.Figure 2 Inner wall of the gastric mucosa in the ulcer model group

2.2 胃黏膜组织HE染色

模型组胃黏膜组织炎细胞浸润及腺体破坏程度十分严重，而施维舒作为广泛使用的抗胃溃疡药品其预防胃溃疡作用效果显著，经施维舒预防给药过的胃组织黏膜与正常对照组形态差异不大。长期服用高浓度山药的小鼠其胃组织黏膜炎细胞浸润及腺体破坏程度较轻，与施维舒治疗组小鼠胃组织差异不大；山药低浓度组对胃溃疡的预防作用不是很明显，其组织的炎细胞浸润及腺体破坏程度比较严重。结果见图3。

2.3 血清MDA、SOD、NO、GSH-Px蛋白表达

整理结果后发现，模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px活性下降，MDA、NO含量增加，相应的溃疡指数也普遍增加，而新鲜山药提取物组小鼠血清MDA、NO含量降低，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)。长期灌胃0.75 g/mL的高浓度山药提取物可以显著提高血清SOD的活性，鲜山药提取物在0.25 g/mL的剂量下血清SOD活性也有升高，且显示出了一定的量效关系。高剂量的鲜山药提取物在预防和抑制消炎痛所致的小鼠急性胃溃疡中具有一定作用。山药高浓度给药对小鼠胃溃疡这一疾病的预防效果最佳，与施维舒药物的效果相近，但是低浓度山药的预防效果相比之下不显著，有待进一步深入研究。结果见表2～表5。

组别Groups用药剂量(g/kg)DoseSOD(U/mL)空白对照组Control group—33.74±1.97模型组Model group—7.63±2.12*施维舒阳性组Teprenone group0.0231.57±1.87#山药高浓度组High dose of fresh yam extract7.521.67±2.22#**山药低浓度组Low dose of fresh yam extract2.514.72±2.32#**

表3 新鲜山药提取物对血清MDA表达的影响

表4 新鲜山药提取物对血清GSH-Px活力的影响

表5 新鲜山药提取物对血清NO含量的影响

3 讨论

山药主产于广西、河北、河南等地，其性属甘且温和，具有多种生物活性，常食之可以强身健体、延缓衰老、补脾胃亏损[6-7]。目前研究显示，山药具有增加胃黏膜碱性成纤维细胞生长因子受体[8]、血清表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)表达及降低血清胃泌素含量的作用[9]。

近年临床研究表明氧化应激损伤和炎症反应已成为急性胃溃疡的重要诱导因素。从大量医学报道我们得知消炎痛诱导的氧化应激损伤不仅会破坏胃粘膜层、破坏为防御系统，严重的溃疡甚至可能通过破坏氧化还原敏感的转录因子，从而加重机体炎症反应[10]。随着现代医学的发展，其药物治疗在一定程度上能够控制症状，但同时服用药物又可能引发肝肾等不良反应，进一步加剧胃的负担，因此探究天然具有胃溃疡保护作用的食物是一条较为适当的途径，药食同源的山药就能够提供人们日常饮食与良好保健功效的需要。

本实验以2.5 mg/mL消炎痛一次灌胃建立急性小鼠胃溃疡模型，最先观察到模型组小鼠出现步履慌张、精神萎靡不振症状。同时测量其溃疡抑制率显著下降，导致部分组织出现氧化应激现象[11-13]。SOD和GSH-Px为重要的抗氧化酶，胃组织氧化产生的过氧化物被SOD和GSH-Px还原后，被转换为毒害较低或无害成分，从而利于胃溃疡造成黏膜损伤的恢复。本实验结果显示，药物新鲜山药提取物可通过增强动物体内氧自由基清除酶SOD的活性[9,14-19]，降低氧自由基的含量，从而降低胃溃疡损伤，促进胃黏膜的愈合。GSH-Px是催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。能够催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，后特异性生成氧化型谷胱甘肽GSSG，以此机制保护生物膜免受ROS的损害。从实验结果看出，与模型组相比，山药高剂量组GSH-Px含量增高(P<0.05)，说明新鲜山药提取物确实具有一定的胃溃疡预防作用。

NO是具有多种生物学活性的自由基气体分子。适度的NO可舒张血管，维持胃黏膜上皮完整性，增加胃黏膜血流量，且研究表明NO可保护胃黏膜细胞，降低损伤易感性[20-21]。然而疾病情况下所产生的大量NO可与氧自由基结合生成过氧化亚硝酸离子(ONOO-)，使细胞脂质发生过氧化反应，引起炎性损伤[22]。MDA是氧化应激的标志物，胃组织发生损伤后会大量生成，使得氧化与抗氧化平衡体系被打破，局部氧化应激加剧，可作为判断胃溃疡的指标[23-24]，而新鲜山药提取物可显著抑制消炎痛处理所致的小鼠血清MDA含量增加(P<0.05)。

病理诊断是现阶段临床医学领域一种重要的诊断方法，对疾病的后续治疗方案构建提供了重要依据，是疾病诊断金标准[7]。在5组HE染色图片的对比中，可见模型组胃组织炎细胞浸润及腺体破坏程度十分严重，而施维舒作为广泛使用的抗胃溃疡药品其预防胃溃疡作用效果显著，经预防给药过的胃组织与正常组差异不明显。长期服用高浓度山药的小鼠其胃组织炎细胞浸润及腺体破坏程度较轻，与施维舒治疗组小鼠胃组织形态结构差异不大，山药低浓度组对胃溃疡的预防作用效果不显著，其组织的炎细胞浸润及腺体破坏程度比较严重。由此得出结论，山药高浓度给药对小鼠胃溃疡这一疾病的预防效果最佳，与施维舒药物的效果相近，但是低浓度山药的预防效果相比之下不显著，有待进一步深入研究。鲜山药提取物具有保护胃黏膜预防急性胃溃疡的作用，其机制与降低MDA、NO因子表达，增加SOD、GSH-Px因子活力，发挥抗氧化应激作用有关。