水稻蛋白组分鉴定方法及其在食味品质评价上的应用

兰静 贾雯靖 孙向东 赵琳 金海涛 王冰 张瑞英*

（1 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，哈尔滨150086；2 农业农村部农产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨150086；第一作者：15004681709@163.com；*通讯作者：zhruiying@163.com）

水稻是人类的主要粮食作物，尤其亚洲国家（如中国、日本、南亚等国家）多以稻米为主食。在亚洲地区，大米为当地人口提供高达50%以上的饮食能量需求，占有极高的比例[1-2]。近年来，随着生活水平的提高，人们对稻米的追求逐渐由产量转至食味品质[3-4]。影响稻米食味的主要因素是蛋白质含量及直链淀粉含量等[5]。稻米中的蛋白质是公认的最优植物蛋白[6-7]，具有降低胆固醇和降低体脂等作用[8-9]。蛋白质作为稻米品质的主要性状，是稻米品质改良不可忽视的重要因子，然而其相关研究还较为薄弱。水稻蛋白质按照功能划分，可分为贮藏蛋白和结构蛋白。水稻种子中绝大多数的蛋白质是贮藏蛋白，结构蛋白是维持种子细胞正常代谢的蛋白，相对较少。水稻贮藏蛋白质主要存在于胚乳，按溶解性可分为球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[10]。谷蛋白是稻米中重要的贮藏蛋白[11-12]，其含量占种子总蛋白的80%左右[13]，它是稻米中仅次于淀粉易于被人体消化吸收的主要胚乳成分[14]。醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白的占比则分别为1%～5%、2%～10%、2%～5%[15-17]。我国稻米产量居世界第一，但由于稻米品质以及品质检测技术落后等原因，我国的稻米在国际市场上缺乏竞争力[18-19]。关于蛋白质与稻米品质之间的关系，国内外已有很多报道[20]，但主要集中在表观蛋白质含量与食味品质之间的关系变化上。如有研究表明，稻米的蛋白质含量越低，则其食味评分越高[21]。WAKAMATSU 等[22-23]通过设置不同的氮肥处理以增加籽粒蛋白质含量，结果表明，食味较好的稻米蛋白质含量在6%～7%，大于7%则食味会降低。稻米食味值与谷蛋白的含量呈不显著的负相关，说明随着谷蛋白含量的增加，稻米的食味品质有下降趋势[24]。清蛋白是与稻米食味品质优劣关系更密切的蛋白，目前对稻米清蛋白的研究甚少。马建[25]研究了几种电泳技术在水稻品种鉴定上的应用，并未与食味建立相关关系。大多数对蛋白质与食味品质的研究主要关注点是氮素方面[26]。目前，水稻蛋白电泳技术仅应用于品种鉴定方面，在稻米食味品质研究中的应用较少。且对蛋白质含量与水稻食味品质的关系研究仅停留在表观蛋白质含量上。因此将水稻蛋白质电泳技术应用于食味品质评价中，有助于水稻品质改良的研究，为提高稻米品质奠定基础。本文在前人研究基础上，改进并优化了水稻谷蛋白和清蛋白电泳方法，并应用于稻米食味品质研究中，从蛋白质组分分析稻米食味品质，为优质水稻早期世代材料筛选及品质改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 水稻品种来源

以粗蛋白质含量接近、食味评分不同的水稻品种龙粳香1 号、长粒香2 号、垦粳12、龙粳29、五优稻、高粱稻为试验材料，具体见表1。其中，长粒香2 号分别来源于同江市和富锦市。

表1 不同来源水稻品种蛋白质含量及食味评分

图1 不同谷蛋白提取方法电泳图谱比较

1.1.2 化学试剂

所有试剂都是国产或进口分析纯，用蒸馏水配制有关溶液，电泳仪和电泳槽型号为BIO-RAD Power Pac，产地新加坡。

1.2 试验方法

1.2.1 大米粉制备

稻米经自然风干后，称取100 g，先用糙米机碾成糙米，再将糙米通过精米机碾成精米。精米经磨粉机碾磨成粉，于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 水稻蛋白提取

谷蛋白：参考马健[25]的方法并进行了优化。称取40 g 大米粉于烧杯中，加入40 mL 蒸馏水浸泡。搅拌至混匀，静置1 h，手动搅拌15 min，4 000 r/min 的转速离心5 min，弃上清。沉淀加入40 mL 0.03 mol/L NaoH（aq），手动搅拌18 min，4 000 r/min 的转速离心10 min，取上清，调pH 值至4.8，再用4 000 r/min 转速离心10 min。收集沉淀，水洗3 次，得到的谷蛋白自然阴干，于-20℃条件下保存备用。

清蛋白：参考杨静等[24]的方法并进行了优化。提取清蛋白的溶剂为蒸馏水。大米粉与蒸馏水比为1∶1，摇床振荡提取2 h。15000r/min 的转速离心5 min。取上清于2 mL 离心管内，于-20°C 条件下保存备用。

1.2.3 凝胶配制

1.2.2.1 分离胶的配制 （1）27.23 g Trizma base 溶解于80 mL 的蒸馏水中，用盐酸调pH 值至8.8，蒸馏水定容至150 mL。（2）量取步骤1 中的溶液25 mL，加入40 mL 的30% Monomer Sol'n、1 mL 10%SDS、33.5 mL的蒸馏水混匀，4°C 保存备用。（3）量取步骤2 中的溶液9.95 mL，加入50 uL 10% 过硫酸铵，5 uL 的TEMED，混匀，灌入胶板中。上层加入蒸馏水封口。等待分离胶凝固。

1.2.2.2 浓缩胶的配制 （1）6.0 g Trizma base 溶解于60 mL 的蒸馏水中，用盐酸调pH 值至6.8，蒸馏水定容至100 mL。（2）量取步骤1 中的溶液25 mL，加入13 mL 的30% Monomer Sol’n，0.5 mL 10%SDS，61 mL 的蒸馏水混匀，4℃保存备用。（3）量取步骤2 中的溶液10 mL，加入50 uL 10% 过硫酸铵、10 uL 的TEMED 混匀。待分离胶凝固，倒出表面的水层，将配制好的浓缩胶灌入胶板中。然后插入梳子，等待凝固。

1.2.4 电泳

蛋白提取液的配制：0.125 mol/L Tris-Hcl（pH 值6.8）、4% SDS、20%甘油、4 mol/L 脲素、5% 巯基乙醇。

谷蛋白进样量为7 μL，清蛋白进样量为10 μL。电泳开始时，恒定电压为100V ，当样品到达分离胶时，电压降至80V，电泳2.5 h。

1.2.5 蛋白固定

电泳结束，取出凝胶。将凝胶浸入40 mL 的10%三氯乙酸中，摇床振荡固定蛋白。过夜固定。

1.2.6 染色与脱色

凝胶置于40 mL 考马斯亮蓝R-250 溶液中，摇床染色2 h。然后在冰乙酸、甲醇、水混合溶液（三者比为10∶45∶45）中脱色。

2 结果与分析

2.1 水稻谷蛋白电泳

2.1.1 水稻谷蛋白提取方法的优化

图1A 是采用文献中碱提酸沉的方法提取的水稻谷蛋白，即将大米粉以一定的固液比直接浸泡于碱液中，然后进行酸沉。得到的图谱效果很差，谱带模糊。图1B 图则是进行改进后的谷蛋白图谱，先用水浸泡大米粉，再加入碱液，酸沉得到谷蛋白。此方法得到的谷蛋白进行电泳图谱清晰度明显优于图1A。但是优化后的图谱也存在一定问题，如杂带太多、清晰度稍差等。

因水溶性蛋白干扰，需对谷蛋白的提取方法再次优化。采用先水浸提，通过离心的方式去掉大部分水分，加入碱液，同时降低了碱液的浓度。再经过酸沉、水洗得到谷蛋白，进行电泳试验，得到的图谱如图1 C。该图谱谱带分明，清晰度也很好。

2.2.2 水稻谷蛋白电泳上样量的优化

图2 不同谷蛋白进样量电泳图谱比较

图3 北方粳稻与南方粳稻谷蛋白电泳图谱比较

图4 蛋白质含量相近水稻谷蛋白电泳图谱比较

图2 中左边的图采用的进样量为10 uL，发现谱带不清晰。对进样量进行了优化，从5～9 uL 之间进行了试验，结果表明，7 uL 是最适宜的上样量。

2.2.3 水稻谷蛋白电泳应用

2.2.3.1 北方大米与南方大米样品谷蛋白电泳差异分析 由图3 看出，3 个东北大米之间谱带无差异，4 个来源于江苏的大米样品之间谱带也无差异。但东北大米和江苏大米的图谱出现了差异，B3565（南粳9108）在60 kDa 处谱带缺失。可见，水稻谷蛋白电泳能够鉴定南方水稻与北方水稻谷蛋白亚基结构差异。

2.2.3.2 蛋白质含量相近的大米样品谷蛋白电泳差异分析 选取蛋白质含量接近、食味评分相差较大的大米样品进行谷蛋白电泳图谱分析，发现样品蛋白质含量变异幅度为7.70%～7.91%，食味评分变异幅度为71～90 分。由图4 可知，7 个样品的谱带并没有明显的差异。

图5 蛋白质含量相近的水稻清蛋白电泳图谱比较

2.3 水稻清蛋白电泳

2.3.1 蛋白质含量相近的大米样品清蛋白电泳差异分析

对蛋白质含量接近、食味评分相差较大的7 个样品进行清蛋白电泳图谱分析。从图5 可以看出，龙粳香1 号水稻样品谱带与其他样品谱带不同，在70～105 kDa 处出现了谱带的缺失。在105 kDa 处，长粒香2 号条带也出现了谱带的缺失。由表1 看出，这2 个样品的食味评分很低。谱带颜色较深的高粱稻，其食味评分最高。龙粳29 和五优稻的谱带颜色次之，其食味评分也对应下降。

3 讨论与结论

按照现有谷蛋白电泳方法进行水稻谷蛋白电泳，发现水稻样品谱带重叠无法区分，通过查阅大量资料，经过反复试验，笔者在蛋白质提取方法、化学试剂用量等方面进行了改进，建立了一种新的谷蛋白电泳方法。采用新的谷蛋白电泳方法对蛋白质含量相近、食味值有差异的水稻样品进行谱带分析，发现品种之间谱带无差异；对北方粳稻与南方粳稻品种进行谷蛋白电泳谱带分析，发现北方粳稻与南方粳稻品种谱带有差异，而北方粳稻品种之间或南方粳稻品种之间谱带差异不大。

目前，有关水稻清蛋白电泳方法研究较少，利用该方法对水稻食味品质进行评价尚未见相关报道。现有研究表明，水稻表观蛋白质含量越低，米饭食味值越高。本研究对表观蛋白质含量相近、食味值差异较大的水稻品种进行清蛋白电泳图谱分析，发现105 kDa 处谱带缺失，其米饭食味值较低；105 kDa 处谱带颜色越深，其米饭食味值越高。105 kDa 为水稻食味优质亚基。本研究为初步结果，下一步需通过液相色谱法定量检测做进一步验证工作。