ATG5/7参与METH和HIV-1Tat蛋白协同诱导的树鼩中脑神经元自噬

李 娟，晏和熙，李红梅，吕丽琼，曾晓锋，代解杰

(1.昆明医科大学基础医学院，昆明 650500； 2.中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，实验树鼩标准化与应用研究云南省创新团队，昆明 650118； 3.昆明医科大学法医学院，昆明 650500)

众所周知，HIV感染和毒品滥用是当今世界上严重两大的社会和公共卫生问题，目前临床使用的抗逆转录病毒疗法(cART)虽然改善了HIV感染者的健康状况，但是不能改善HIV相关神经认知障碍(HAND)的症状，因此，HAND仍然是HIV感染者面临的主要问题之一[1]，而毒品的滥用增加了HAND的风险。METH即甲基苯丙胺(Mmethamphetamine, METH)也称为“冰毒”，会影响中枢神经系统功能的正常发挥。甲基苯丙胺滥用常常伴随HIV病毒的感染，而且甲基苯丙胺可以影响HIV病毒的复制和发病机制[2]，这些HIV感染者也表现出更大的神经损伤和更高的认知能力下降。

HIV-1Tat蛋白是一种病毒蛋白，可以通过诱导神经细胞凋亡、自噬以及神经突触的改变，产生神经毒性，是HAND的主要致病因子之一[3-4]。而METH能够刺激多巴胺神经元产生活性氧分子(ROS)从而导致谷氨酸代谢异常[5]，因而产生神经毒性。之前我们报道，METH和HIV-1Tat蛋白可以显著增加神经细胞凋亡和自噬的风险，两者具有协同作用[6-7]，然而这种协同作用的分子机制还不清楚。

细胞死亡可以是偶然死亡，也可以是程序化死亡，都是为了维持细胞内环境的稳定。程序性细胞死亡依赖于特定的信号通路，导致裂解或非裂解形态，有凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)两种形式。自噬意即细胞的自我吞噬，是通过降解和回收细胞成分来维持细胞稳态，需要超过30多种自噬相关蛋白(ATG)来进行调节这个过程[8]。树鼩(Tupaia Belangeri)虽然是一种小型哺乳动物，但是因为它与人类的亲缘关系相近，一些研究人员甚至将树鼩归类为一种独立的哺乳动物分类群[9]，而且树鼩大脑较发达，因此很多研究者将树鼩作为研究人类神经系统疾病的动物模型。

之前我们已经报道METH和HIV-1Tat蛋白能够协同诱导树鼩中脑神经元自噬，而ATG5/7蛋白参与了两者诱导的自噬，METH和HIV-1Tat蛋白诱导的细胞氧化应激可能是引起自噬的基本原因[7]。据研究应激诱导的细胞自噬初期可能会起到保护细胞的作用，但应激状态持续，细胞无法适应这种应激，则会引起细胞凋亡[10]。ATG5和ATG7作为两种重要的自噬相关蛋白参与了METH和HIV-Tat蛋白诱导的自噬，对于维持细胞的内环境有一定的作用，然而氧化应激持续进行时，细胞是如何调节自噬并不完全被了解。而本研究则进一步证实METH和HIV-1Tat蛋白通过增加ATG5/7基因的表达上调ATG5/7蛋白，进而调控两者诱导的神经元自噬，探讨自噬的潜在机制，揭示吸毒人员引起的艾滋病脑病的发病机制，对于寻找合适的药物治疗靶点有一定的临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物

中缅树鼩滇西亚种(Tree Shrew, Tupaia Belangeri Chinesis)(新生3 d内)10只，普通级，雌雄各半，体重9.1～ 16.5 g，平均(13.1±1.2) g，选取身体虚弱，母树鼩不给予哺乳、出生3 d内的乳树鼩，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供，实验动物生产许可证号[SCXK(滇)K2018-0002]，使用许可证号[SYXK(滇)K2018-0002]。同时中国医学科学院医学生物学研究所实验动物福利伦理委员会批准了本研究(DWSP2017053)，实验过程中按照实验动物使用的3R原则，所有树鼩给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

LC3B rabbit Ab(2775s)，Beclin-1 rabbit Ab(3738s)，Anti-rabbit IgG-HRP(7074s)，Anti-mouse IgG-HRP(7076s)购于Cell Signaling Technology公司。ATG5 rabbit Ab(ab108327)，ATG7 rabbit Ab(ab133528)购于abcam公司。Anti-β-Actin Mouse Ab(A1978)购于Sigma公司；胎牛血清(1739464)，B27 supplement(50X)(17504-044)，Pen Strep(15140-122)，0.25% Trypsin-EDTA(25200-056)，Neurobasal-a 培养基(10888-022)购于Gibco公司；DMEM/F12 培养基(SH30023.01)购于Hyclone公司；Western Blot 相关试剂购于上海碧云天生物技术有限公司；HIV-Tat蛋白Clade-B(HIV-129-c)购于PROSPEC公司，甲基苯丙胺(化学对照品，纯度>99%，Methylamphetamine)(171212-200603)购于中国药品生物制品检定所；RNAzol RNA提取试剂(RN190)购于MRC公司，RT-PCR一步法RT-PCR试剂盒SYBR Green染料法(1708892)购于BIO-RAD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 树鼩中脑神经元分离、培养

树鼩中脑神经元分离、培养方法见参考文献[7]。

1.3.2 引物设计、合成

从NCBI数据库中查找ATG5和ATG7的序列，设计qRT-PCR检测引物, ATG5引物序列正向：5’- GCCATCAATCGGAAACTCAT-3’，反向：5’-CACAGGACGGAACAGCTTCT-3’，ATG7引物序列正向：5’-GCCCTGTGTCTTCCAGAGAG-5’，反向：5’- AGTGCCGTGACTCCTTCTGT-3’；同时以GADPH作为内参基因，GAPDH引物序列正向：5’-CAT GGC ACC GTC AAG GCT GAG AA-3’，反向：5’-CAG TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA-3’，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 RNA提取以及荧光定量RT-PCR

采用TRIzol 法提取树鼩中脑神经元中的mRNA，并对其进行浓度和纯度的测定。使用一步法SYBR Green荧光PCR进行RT-PCR反应，所得数据采用2-ΔΔCT法进行计算分析。

1.3.4 Western blot

用Western和IP裂解液提取蛋白，经BCA法测定蛋白浓度。取25 μg蛋白，经SDS-PAGE蛋白分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后加入一抗(LC3、Beclin-1、ATG5、ATG7，稀释比例均为1∶1000，β-actin 稀释比例为1∶2000)，4℃孵育过夜，用1×PBST 清洗干净后，放入二抗中室温孵育2 h，用ECL显色液显色，利用Image J软件分析灰度值，每次实验重复3次。

1.4 统计学方法

本实验数据分析使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.00软件，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，结果以P<0.05具有统计学意义。HIV-1Tat蛋白和/或METH诱导的Beclin-1、 LC3B、ATG5/7蛋白使用Bliss独立模型(Bliss independence model)计算两者是否具有协同效应，效应值< 1为协同(synergistic)=1 为叠加(additive)，> 1为拮抗(antagonistic)[11]。

2 结果

2.1 METH和HIV-1Tat蛋白协同诱导树鼩中脑神经元自噬

根据之前研究结果[7]本文用HIV-1Tat蛋白(100 nmol/L)单独 /联合 METH(0.5 mmol/L)作用细胞24 h，检测细胞中自噬蛋白Beclin-1和 LC3B蛋白的表达水平(图1)。 METH和HIV-1Tat蛋白均可以提高细胞中Beclin-1和 LC3B蛋白的表达，与对照组相比，HIV-1Tat蛋白诱导细胞Beclin-1和LC3B蛋白的表达分别上升了2.2倍(P<0.05)和 1.8倍(P<0.001)；METH诱导细胞Beclin-1和LC3B蛋白表达分别上升了3.4 倍(P<0.05)和 2.3倍(P<0.01)。 METH和HIV-1Tat蛋白联合作用细胞后，细胞中Beclin-1和LC3B蛋白明显升高，高于其余组，有显著性差异(P<0.001)。METH和HIV-1Tat蛋白两者联合诱导细胞Beclin-1和LC3B蛋白的效应值分别是0.77和0.76，具有协同效应。

2.2 ATG5和ATG7参与了两者诱导的细胞自噬

本文检测了细胞中自噬蛋白ATG5/7的表达水平，如图2所示：给予细胞METH和HIV-1Tat蛋白治疗后，细胞中ATG5/7蛋白表达量升高。HIV-1Tat蛋白单独作用细胞后，细胞中ATG5/7蛋白表达比对照组分别上调了1.1倍(P<0.05)和1.0倍(P<0.01)，METH作用细胞后，细胞中ATG5/7蛋白表达比对照组上调了1.2倍(P<0.05)和1.0倍(P<0.01)，而两者同时作用细胞后，细胞中ATG5/7蛋白表达量明显上升，作用效应分别是0.84(ATG5)和0.64(ATG7)，具有协同效应。而PCR结果显示(图3)，单独给予HIV-1Tat蛋白治疗后，ATG5/7基因的表达量升高，分别是对照组的99倍(P<0.05)和129倍(P<0.01)；单独应用METH治疗后ATG5/7基因的表达量也升高，分别是对照组的114倍(P<0.01)和128倍(P<0.01)；HIV-1Tat蛋白和METH两者联合明显上调ATG5/7的表达量，与单独药物组和对照组比，差异有显著性，具有统计学意义。

注： A：WB结果；B： Beclin-1蛋白灰度值与β-action灰度值比值；C： LC3B蛋白灰度值与β-action灰度值比值。灰度值测定用Image J软件，数据分析及作图使用Graphpad Prism软件。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与M+T组相比，# P<0.05，###P<0.001。图1 METH和HIV-1Tat蛋白诱导细胞后Beclin-1和LC3B蛋白表达Note. A， The data were analyzed using western blotting. B， The ratio of Beclin-1/β-action. C， The ratio of LC3B/β-action. The data were quantified by Image J software, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software. Representative blot images are shown.Compared with control.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with M+T. #P < 0.05,### P<0.001.Figure 1 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the protein levels of Beclin-1 and LC3B were analyzed by Western blot.

注: A：WB结果；B：ATG5蛋白灰度值与β-action灰度值比值；C：ATG7蛋白灰度值与β-action灰度值比值。灰度值测定用Image J软件，数据分析及作图使用Graphpad Prism软件。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与M+T组相比，# P<0.05，###P<0.001。图2 METH和HIV-1Tat蛋白诱导细胞ATG5和ATG7蛋白表达Note. A, The data were analyzed using western blotting. B, The ratio of ATG5/β-action. C, The ratio of ATG7/β-action. The data were quantified by Image J software, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software. Representative blot images are shown.Compared with control.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with M+T,#P<0.05,##P<0.01.Figure 2 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the protein levels of ATG5 and ATG7 were analyzed by Western blot

注:与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与M+T组相比，#P<0.05，##P<0.01。图3 METH和HIV-1Tat蛋白诱导细胞ATG5和ATG7基因表达Note. A, The expression levels of mRNA ATG5. B, The expression levels of mRNA ATG7. The data were calculated and analyzed by 2-ΔΔCT method, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software.Compared with control,*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001. Compared with M+T,# P<0.05, ##P<0.01. Figure 3 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the expression levels of mRNA ATG5 and ATG7

3 讨论

HIV感染者滥用METH增加了HAND发生的风险。据研究，METH通过下降神经突触前和突触后蛋白降低HIV-1Tat转基因(Tat-Tg)小鼠的工作记忆和空间记忆，并且服用METH的Tat-Tg小鼠在空间记忆方面具有明显的缺陷[12]。METH和HIV-1Tat能协同增强大鼠和SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)的氧化应激反应，从而损伤大鼠的血脑屏障，诱导细胞凋亡和自噬，增加神经毒性[13-14]。

哺乳动物的自噬可以在缺氧、饥饿、病毒侵入等应激情况下增强，有利于细胞的存活，但是过度自噬则会导致细胞死亡。在酵母和哺乳动物中，有两种泛素样(ubiquitin-like, UBL)蛋白的共轭系统利于噬菌体扩大延伸[15]，其中一个系统是ATG12-ATG5-ATG16复合体。在酵母中，ATG5依赖E1激酶而激活，而ATG7作为一种独特的E1酶，激活ATG12并将其转化为不同的E2酶[16]。研究发现ATG5/7依赖性自噬在吗啡成瘾以及神经元树突调节中起着关键作用[17]。Zheng等[18]通过Ad-ATG5/7重组腺病毒转染小鼠软骨细胞后，发现ATG5/7蛋白可以通过PERK信号通路促进自噬。Yang等[19]认为METH通过AKT/mTOR信号通路调控神经细胞自噬，而天麻素能够减轻其诱导的自噬，从而起到保护作用。在本研究中，METH和HIV-1Tat蛋白协同可以显著上调ATG5/7基因的表达水平，从而调控蛋白表达促进细胞自噬，增加细胞毒性。

本研究的结果揭示METH和HIV-1Tat蛋白通过上调ATG5/7基因的表达，协同诱导树鼩中脑神经元自噬，从而为了解HIV感染的METH吸毒患者神经认知障碍的分子机制提供了新的见解和理论依据。同时树鼩的原代中脑神经元可以作为研究HIV-1Tat蛋白和METH自噬的一个模型，为进一步的研究提供一个新的方向。