脐带间充质干细胞对卵巢早衰家兔性激素、CYR61和CTGF表达的影响

张 娟，王 晶，周 丽，庹 平，王 刚，朱楚超

(1.中国人民解放军中部战区总医院妇产科，武汉 430070； 2.湖北中医药大学，武汉 430065； 3.中国人民解放军中部战区总医院医学实验科，武汉 430070)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指40岁以下的妇女卵巢内卵泡迅速减少，没有或几乎没有卵泡残留的一种疾病，临床以无生育能力和闭经为主要表现[1]。该病临床发病率为1%，但一旦发病，常给患者带来身体上和心理上的双重打击，患者会出现焦虑、抑郁等精神症状[2]。研究显示，该病的发生可能与自身免疫、代谢、感染和医源性因素等有关[3-4]。目前临床上普遍的治疗方法为激素替代疗法[5]，虽能改善临床症状，但很难恢复卵巢功能，而且长期使用会增加患癌症的风险，所以临床上亟待寻求一种更加有效和安全的治疗方法。研究阐明[6]，脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UCMSCs)具有自我更新、多方向分化、促进损伤修复和调节免疫等功能，并且有取材简单、免疫原性低、无伦理学争议等优点。近来有研究显示[7-8]，UCMSCs能依赖于旁分泌提高卵巢储备，在治疗POF中起到一定疗效，是针对POF的非常有前景的一种疗法。本实验研究以家兔为对象，观察UCMSCs治疗后富半胱氨酸蛋白61(CYR61)和结缔组织生长因子(CTGF)的表达、mRNA的表达和激素水平变化，探讨研究UCMSCs对卵巢早衰的治疗作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取普通级5月龄雌性未交配日本大耳兔10只，体重2.6～2.8 kg，购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司[SCXK(鄂)2016-0011]，饲养于中国人民解放军中部战区总医院医学实验中心[SYXK(鄂)2014-0082]，室温为(22±2)℃，相对湿度为50～60%，12 h明暗交替光照，自由饮食饮水，适应性饲养1周，经阴道脱落细胞涂片检查确定其动情周期正常后开始实验。实验方案经我院伦理委员会批准(2016020)，按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

注射用环磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，注册证号：H20110407)；兔雌二醇酶联免疫试剂盒(武汉博欧特生物科技有限公司，产品编号：orb409999)；兔促卵泡激素酶联免疫试剂盒(武汉博欧特生物科技有限公司，产品编号：orb410001)；cDNA第一链合成试剂盒(RevertAid RT Reverse Transcription Kit，K1621，Thermo)、反转录试剂盒(SYBR FAST qPCR Master Mix，KK4604，sigma)；CRY61兔抗兔多克隆抗体(Novus，NB100-356)；CTGF兔抗兔多克隆抗体(Boster，BA0752)；GAPDH小鼠抗兔单克隆抗体(Abcam，ab8245)；流式抗体APC Mouse anti-Human CD29 (BD，559883)、PE Mouse anti-Human CD34(BD，550761)、PE Mouse anti-Human CD44 (BD，561858)、BB515 Mouse anti-Human CD45(BD，564585)；LightCycle 96型荧光定量PCR仪(ROCHE)；L600型离心机(湘仪仪器厂)；RM2016型轮转式切片机(上海徕卡仪器有限公司)；BX51型奥林巴斯荧光显微镜；YD-6 L生物组织包埋机(金华市益迪医疗设备有限公司)。

图1 UCMSCs流式细胞仪检测结果Figure 1 Changes of UCMSCs detected by flow cytometry

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备

根据团队前期研究[9]，以50 mg/kg剂量连续注射2 d是建立环磷酰胺(CTX)诱导家兔POF模型的最佳造模方式。故本实验采取CTX腹腔注射的方法建造POF模型，10只家兔均用CTX 50 mg/(kg·d)腹腔注射，连续注射2 d。造模后家兔出现不同程度脱毛，进食减少，活动反应降低，体重下降等症状，并且采血检查显示有血清雌二醇(E2)水平下降，促卵泡生成素(FSH)水平上升。

1.3.2 分组

采用随机数字表法将10只家兔随机分为模型组和治疗组各5只。

1.3.3 干预

(1)UCMSCs培养及鉴定

取中国人民解放军中部战区总医院妇产科足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，产妇签署知情同意书，并报医院伦理委员会批准。所取标本用PBS冲洗干净，并剔除血管，将组织处理至1～2 mm，加入培养基(10%胎牛血清的DMEM-F12培养液)，置于5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。5～7 d后第1次传代后每3 d按1∶3比例传代，进行扩增培养。取第3代UCMSCs，制成单细胞悬液200 μL于EP管，分别加入抗体CD29-APC(20 μL)、CD34-PE(20 μL)、CD44 -PE(20 μL)、CD45-BB515(5 μL)，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测结果示：贴壁细胞表达CD29和CD44，不表达CD34和CD45，为人体脐带间充质干细胞。详见图1。

(2)干预治疗

治疗组5只POF家兔在造模一周后，通过耳缘静脉注射5×106/mL的UCMSCs，每天注射2 mL，连续注射3 d。模型组注射等量的灭菌用水。

1.3.4 观察指标

(1)激素水平测定

UCMSCs治疗后0 d、7 d、14 d和28 d，分别取模型组和治疗组家兔各3只，抽取静脉血查激素水平。

(2)卵巢组织CYR61和CTGF蛋白表达

采用蛋白免疫印迹法检测。治疗28 d后，将两组家兔处死后取一侧卵巢，切取适量新鲜组织液氮速冻，放入-80℃冰箱中，后取100 mg剪切成细小的碎片，加入1000 μL RIPA裂解液，匀浆，充分裂解，12000 r/min离心5 min，取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。每个样本取40 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，按浓缩胶80 V、分离胶120 V进行恒压电泳，至溴酚蓝刚出胶。将凝胶上蛋白转至PVDF膜，按150 mA恒流转膜。稀释一抗(CRY61∶1/200，CTGF：1/1000，GAPDH：1/2000)，4℃过夜，二抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶)稀释10000倍，室温下30 min，TBST洗膜，滴加等体积混匀ECL显影液，放入凝胶成像仪中曝光成像。以GAPDH作为内参，采用Image J 1.8.0软件分析灰度值。

(3)卵巢组织CYR61和CTGF mRNA表达

采用实时荧光定量PCR技术检测。卵巢组织按Trizol法提取总RNA，测定纯度和浓度，逆转录后进行扩增。引物：GAPDH：上游5’-TTCCACGGCAC GGTCAAG-3’，下游5’-ACTCGGCACCAGCATCAC-3’；CYR61：上游5’-GAAGTCTCCCGAAGCAGTCAG-3’，下游5’-GTCTCGCCGTCCTCACAG-3’；CTGF：上游5’-GGAGTGGGTGTGTGACGAG-3’，5’-CCGC AGGTCTTGGAACAGG-3’，采用2-△△Ct法进行相对表达量分析。

(4)免疫组化检测卵巢组织CYR61和CTGF蛋白表达

除上述冻存新鲜组织外，剩余组织放入4%多聚甲醛常温固定，石蜡包埋后，6 μm连续切片使用，切片组织脱蜡、抗原修复后封闭，滴加100 μL稀释的一抗(CRY61∶1/200、CTGF：1/100)，4℃过夜，PBS冲洗。滴加100 μL生物素标记二抗工作液(1/150稀释)，37℃孵育30 min，PBS冲洗，孵育SABC，滴加DAB显色液，室温显色。滴加200 μL苏木素染色液孵育30 s，饱和磷酸氢二钠溶液浸泡1 min返蓝，以中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组激素水平比较

模型组和治疗组在未治疗前血清E2和FSH水平无差异，有可比性(P>0.05)。治疗后家兔血清E2水平上升，FSH水平下降，与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，并且随着时间出现周期性波动；而模型组家兔一直处于低E2和高FSH水平，随着时间未出现周期性的波动。详见表1、2和图2、3。

2.2 两组CYR61和CTGF蛋白表达比较

模型组CYR61和CTGF蛋白表达较低，分别为0.390±0.040和0.186±0.054，治疗组蛋白表达量明显增多，分别为0.756±0.085和0.693±0.098，与模型组相比较，差异均有统计学意义(tCYR61=8.688，P<0.05；tCTGF=10.142，P<0.05)，见图4和图5。

2.3 两组CYR61和CTGF mRNA表达比较

模型组CYR61和CTGF mRNA表达水平较低，分别为0.003±0.001和0.002±0.001，而治疗组mRNA的表达水平明显升高，分别为0.010±0.001和0.016±0.002，与模型组比较，差异均有统计学意义(tCYR61=38.156，P<0.05；tCTGF=14.646，P<0.05)，详见图6。

表1 两组不同采血点E2水平比较

注：F组间=321.914，P组间<0.001；F时间=51.745；P时间<0.001；F交互=186.620，P交互<0.001。

Note.Fintergroup=321.914,Pintergroup<0.001.Ftime=51.745.Ptime<0.001.Finteraction=186.620,Pinteraction<0.001.

表2 两组不同采血点FSH水平比较

注：F组间=694.561，P组间<0.001；F时间=33.990；P时间<0.001；F交互=126.616，P交互<0.001。

Note.Fintergroup=694.561,Pintergroup<0.001.Ftime=33.990.Ptime<0.001.Finteraction=126.616,Pinteraction<0.001.

图2 两组不同采血点E2水平比较Figure 2 Comparison of E2 levels at different blood collection points in the two groups

图3 两组不同采血点FSH水平比较Figure 3 Comparison of FSH levels at different blood collection points in the two groups

图4 两组家兔卵巢组织内CYR61和CTGF蛋白表达(1-5：治疗组，6-10：模型组)Figure 4 Expression of CYR61 and CTGF in ovarian tissue of rabbits (1-5， treatment group. 6-10, model group)

图5 两组家兔卵巢组织内CYR61和CTGF蛋白相对表达量比较Figure 5 Comparison of relative expression levels of CYR61 and CTGF in ovarian tissues of rabbits

2.4 两组免疫组化检测结果比较

图7、8可知，CYR61和CTGF蛋白表达在模型组较少，散在分布，平均光密度值分别为(0.166±0.009)和(0.193±0.008)；治疗组表达明显增多，呈深棕色颗粒状，主要表达在颗粒细胞和卵泡细胞膜，在卵泡细胞膜处更是呈深棕色环状，平均光密度值分别为(0.222±0.030)和(0.224±0.014)，与模型组比较，差异均有统计学意义(tCYR61=3.981，P<0.05；tCTGF=4.111，P<0.05)。

图6 两组家兔卵巢组织内CYR61和CTGF mRNA相对表达量比较Figure 6 Comparison of relative expression levels of CYR61 and CTGF mRNA in ovarian tissues of rabbits

注：A：模型组;B：治疗组，CYR61检测；C：模型组;D：为治疗组,CTGF检测。图7 两组家兔卵巢组织内CYR61和CTGF表达Note. A, Model group. B, Treatment group, CYR61. C, Model group. D, Treatment group, CTGF.Figure 7 Expression of CYR61 and CTGF in ovarian tissue of rabbits

图8 两组家兔卵巢组织内CYR61和CTGF表达平均光密度值比较Figure 8 Comparison of mean optical density values of CYR61 and CTGF expression in ovarian tissue of rabbits

3 讨论

随着社会的发展，各种间充质干细胞越来越多的被应用于医学，也是现代再生医学研究的一大热点。其中UCMSCs取材简单，来源丰富，无伦理学争议，被认为是同种异体移植的最佳来源[6-10]，UCMSCs是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，在医学中具有广阔的应用前景。现代研究表明，UCMSCs能够在许多疾病的治疗中起到一定作用，如在治疗糖尿病方面[11]，UCMSCs能阻断相关的炎症因子和炎症激活，有效缓解胰岛素抵抗；在治疗肝方面[12]，UCMSCs能够通过调节miR-20来调控Caspase-3等活性因子减轻细胞凋亡和基因异常表达，从而改善肝脏缺血再灌注损伤；在治疗骨骼方面[13]，UCMSCs联合骨胶原蛋白能够促进骨再生，修复腰椎板缺损。多项研究阐明，人体间充质干细胞能对CTX诱导的卵巢损伤起到一定的修复作用。Mchamed等[14]的动物试验研究就显示，人体的骨髓间充质干细胞能够刺激POF小鼠卵巢内卵泡的生成和改善相关激素水平。另有一项临床研究显示[15]，在自体骨髓间充质干细胞移植后，2例POF患者第三个月恢复了月经，1例POF患者成功受孕并产下健康胎儿，充分表明应用自体的骨髓间充质干细胞对治疗POF有很好的疗效。

本实验研究中应用注射CTX建造POF模型，始终具有高FSH和低E2水平，生理学上能代表人类POF。有研究阐明[16]，虽然动物卵巢结构和激素周期和人体存在差异，但CTX诱导的动物POF模型是目前该领域研究中最被接受的临床前模型。本研究显示经UCMSCs治疗后，POF家兔体内的E2水平上升，FSH水平下降，并且在治疗后恢复了周期性的波动，证实其治疗有效。最近的证据表明[17]，间充质干细胞的作用不是直接恢复受损的细胞，而是通过阻碍和抑制异常的免疫反应来帮助组织再生，并传递生长因子来实现修复的。CYR61和CTGF均为CCN家族的一员，为细胞外基质相关蛋白[18]。生理情况下，CYR61保持低表达维持机体生理需要，但炎症刺激等多种因素均可导致CYR61表达增加；高表达的CYR61能分泌到胞外基质，通过与细胞表面受体结合，起到促进细胞增殖分化、血管形成以及组织损伤修复等多种作用[19]。相关研究显示[20]，高表达CYR61的人子宫内膜血管周围细胞移植能促进子宫部分全层切除术后大鼠子宫血管生成以及内膜和肌层再生，提高大鼠的妊娠率。CTGF具有促细胞增殖、迁移及分化等作用，与CYR61共同参与细胞内外信号传导。本实验研究中，治疗后CYR61和CTGF蛋白和mRNA的表达呈正相关，表达的主要部位为颗粒细胞和卵泡细胞膜，表明其具有协同作用，共同参与UCMSCs对POF的治疗调节机制。研究显示，CYR61和CTGF除自身能促进新生血管生成外，还能一起上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达间接促进血管生成[21]。另有研究阐明，E2等雌激素能上调CTGF表达，并且此过程受FSH的负调控[22]。UCMSCs也能够分泌VEGF，抑制次级卵泡和囊状卵泡凋亡，促进血管生成；也能分泌多种生长因子，逆转CTX阻断的E2对FSH的负反馈作用，阻止生长卵泡过度耗竭，最终改善卵泡的发育[23-24]。

综上所述，UCMSCs对POF具有一定的治疗作用，其作用机制可能是通过调节卵巢内E2和FSH水平以及上调CYR61和CTGF在局部组织内的表达，进而影响VEGF等表达，促进新生血管的形成，从而促进卵泡再生和组织修复来实现的。