小鼠非开胸式主动脉弓狭窄心衰模型的构建及评价

方明笋，金栌帅，张利棕，马全鑫，金 璐，郎佳丽，傅惠英，寿旗扬*

(1.浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所，杭州 310053； 2.浙江中医药大学第二临床医学院/附属第二医院，杭州 310053； 3.浙江大学化学工程与生物工程学院，杭州 310027)

心力衰竭是临床常见的疾病之一，有着较高的发病率和死亡率，流行病学调查结果显示心力衰竭在我国的发病率在逐年上升，严重危害大众健康[1-2]。临床对于心力衰竭治疗的研究也不胜枚举，但至今还没有特别理想的治疗方案。就临床研究而言，最基础的就是要建立具有代表性的成功的实验动物模型[3]。小鼠是模拟人类疾病模型最常用的实验动物[4]，临床上用于建立小鼠心衰模型的方法多样，主要是通过化学药物诱导和物理手术两种方式，化学药物诱导成功率不高，耗费时间较长。物理手术包括压力超负荷心衰模型、容量超负荷心衰模型和心肌梗死后心衰模型[5-7]。主动脉弓狭窄术(transverse aortic constriction，TAC)是压力超负荷诱导左心室肥大及心力衰竭最常用的手术方法[8]。当前TAC术使用的动物品系不一，且手术方法需开胸，小鼠手术创伤很大，死亡率很高，导致模型建立难度大且不稳定，术后心力衰竭病程进度不一[9-11]。因此本文采用改良的小鼠非开胸式TAC术，使用C57BL/6J小鼠建立心力衰竭模型，并对小鼠心力衰竭的病理进程进行分析观察。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠30只，6～8周龄，体重(22±2) g，购自上海灵畅生物科技有限公司[SCXK(沪)2018-0003]；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心[SYXK(浙)2018-0006]，温度：(22±2)℃，湿度：50%～70%，12 h明暗交替，自由饮食。本实验经过浙江中医药大学伦理委员会审批通过(ZSLL-2017-106)，本实验严格遵守实验动物法规及动物福利的相关要求，实验过程中按照3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠(杭州达文生物)，异氟烷(深圳瑞沃德)，Vevo 1100超高分辨率小动物超声影像系统(加拿大Visual Sonics)，Nano Zoomer 2.0 RS 数字切片扫描设备(日本滨松)，鹅颈冷光源灯(深圳瑞沃德)，小鼠显微手术器械(上海医疗器械)，恒温手术保温台(美国Gaymar)，自制L型26G垫针。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立及鉴定

30只小鼠预饲养1周后进行手术，采用0.3%戊巴比妥钠(75 mg/kg)腹腔注射麻醉，掐捏鼠尾，确保没有反射以后胸部和颈部剃毛。使用医用胶布将动物四肢和门齿固定于恒温手术台，温度设定37℃，碘伏消毒手术区域。用眼科剪在小鼠颈部和胸部中线位置纵向切开皮肤0.5～1 cm。使用眼科镊轻轻分离结缔组织和气管中线两侧肌肉。用眼科剪从锁骨处开始切至第二肋骨(约5 mm)。使用显微镊将胸腺两叶彼此分离，此时可清晰看到主动脉弓和两条颈动脉。用显微镊从左颈总动脉和右无名动脉之间，主动脉弓下方轻轻穿过，夹住6-0尼龙缝合线小心拉出(结扎位置见图 1)。将自制L型26G垫针防至主动脉弓旁，将主动脉弓与L型垫针结扎固定，打三个结确保结扎稳固，小心抽去垫针。主动脉弓狭窄成功后可观察到右颈总动脉搏动显著增强。简单间断缝合肌肉和皮肤，碘伏消毒伤口后置于保温台上恢复，苏醒后放回笼具。假手术组方法一致，不结扎。术后3 d肌肉注射青霉素钠，每只5000 U。术后一周应用Vevo 1100超高分辨率小动物超声影像系统及MS400超声探头(探头频率：30 MHz)对主动脉弓部进行血流彩色超声，检测狭窄处血流速度。假手术组主动脉弓血流速度峰值在600～900 mm/s，TAC组主动脉弓狭窄处的血流速度峰值急剧升高，以假手术组血流速度峰值的两倍(大于1600 mm/s)作为TAC术成功的判断标准。

1.3.2 心脏超声检查

应用Vevo 1100超高分辨率小动物超声影像系统及MS400超声探头(探头频率：30 MHz)，分别于术后4、8、12周进行超声检查小鼠心脏获得M型超声心动图像，分析图像获得左室舒张末期前壁厚度(IVS；d)，左室舒收缩末期前壁厚度(IVS；s)，左室舒张末期内径，左室收缩末期内径，左室舒张末期后壁厚度(LVPW；d)，左室舒收缩末期后壁厚度(LVPW；s)，左心室收缩末期容积，左心室舒张末期容积，左心室校正重量，射血分数，短轴率，心输出量，每搏输出量(stroke volume，SV)等数据，分析连续3个心动周期，取其平均值。

1.3.3 左心室质量指数

实验终点时，小鼠称重后CO2安乐死，打开胸腔，取心脏，排尽心脏中血液，滤纸吸干去除左右心耳和主动脉弓，去除右心室游离壁，剩余部分称重作为左心室重量(LW)。将LW/体重(BW)作为左心室质量指数。

1.3.4 病理组织学检查

将心脏从正中部位横向对切成两部分，心尖部分放入中性甲醛固定，做常规石蜡包埋、HE染色和Masson染色，应用Nano Zoomer 2.0 RS数字切片扫描设备扫描病理切片，观察心脏病理变化。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 TAC术小鼠的存活情况及并发症

手术过程中死亡的主要原因是胸膜破损(死亡2只)；结扎时用力过度导致主动脉弓破裂(死亡1只)；抽去垫针时主动脉弓破裂(死亡1只)；缝合时损伤肋间动脉导致大出血(死亡1只)。术后一周内部分动物出现头颈部水肿(死亡1只)，其余动物自行缓解。术后1周总存活率为75%(18/24)。假手术组6只全部存活。

2.2 模型鉴定

术后1周应用超声多普勒检测主动脉弓狭窄处血流速度，TAC组血流速度峰值均大于1600 mm/s(图2)。

2.3 左心室质量指数

TAC术后不同时期BW、LW和LW/BW值的比较结果如图3所示。由图可见BW、LW及LW/BW值随时间逐渐升高，与假手术组比，TAC术后4周均有非常显著性差异(P<0.001)，且TAC术后4周、8周、12周LW/BW均有非常显著性差异(P<0.01)。

图1 主动脉弓狭窄部位示意图Figure 1 Schematic diagram of aortic arch stenosis

注：A：假手术组小鼠主动脉弓部血流彩色超声;B：假手术组小鼠主动脉弓部脉冲多普勒血流频谱;C: TAC术后小鼠主动脉弓部血流彩色超声;D：TAC术后小鼠主动脉弓部脉冲多普勒血流频谱。图2 TAC术后模型鉴定Note. A, Color ultrasound of aortic arch blood flow in mice in the sham-operatedgroup. B, Pulse Doppler flow spectrum of aortic arch in the sham-operatedgroup. C, Color ultrasound of aortic arch blood flow in mice after TAC. D, Pulse Doppler flow spectrum of aortic arch in mice after TAC.Figure 2 Model identification after TAC

注：与假手术组(Sham)比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与TAC术后4周比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与TAC术后8周比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图3 术后不同时期体重(BW)、左心室重量(LW)、左心室质量指数的比较Note. Compared with the sham-operated group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the 4 week after TAC group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001. Compared with the 8 week after TAC group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Figure 3 Comparison of body weight (BW), left ventricular weight (LW),left ventricular mass index at different time points after operation

2.4 TAC术后不同时期心脏超声检查

分别在TAC术后4周、8周、12周对小鼠做心脏超声检查，如图4，可见心室明显增厚。由心超分析得到各指标检查结果如图5所示，统计分析发现，与假手术组对比，术后4周小鼠左室舒张末期前壁厚度，左室收缩末期前壁厚度，左心室校正重量，心率，心输出量等均有非常显著性差异(P<0.01)。术后8周小鼠较假手术组，左室收缩末期内径，左室舒收缩末期后壁厚度，射血分数，短轴率，左心室收缩末期容积等也出现非常显著性差异(P<0.01)。至术后12周，对比假手术组，左室舒张末期内径，左室收缩末期内径，左心室舒张末期容积等进一步变化，具非常显著性差异(P<0.01)。

2.5 TAC术后不同时期心肌病理组织学检查

TAC术后4周、8周、12周对小鼠心肌做病理组织学检查，较假手术组，心肌组织不同程度发生变化。心肌HE染色结果如图6所示，术后不同时期心脏体积不同程度增大。如图6可见假手术组心肌纤维排列紧密整齐，细胞核形态正常，未见异常；TAC术后4周、8周、12周可见不同程度的心肌纤维不规则排列，断裂溶解，肌纤维间间隙增大，且术后12周明显可见病变组织。

心肌Masson染色结果如图6所示，胶原纤维显蓝色，肌纤维显红色，细胞核显黑蓝色[12]。假手术组染色均匀，组织间无明显胶原增生；TAC术后4周血管周围明显胶原增生；术后8周除血管周围，心肌组织间也出现胶原增生；术后12周，血管周围以及组织间可见大量胶原增生，心肌组织明显纤维化，可见心脏已超负荷至发生病变。

3 讨论

注：A：假手术组，B：TAC术后4周，C：TAC术后8周，D：TAC术后12周。图4 假手术组与术后不同时期心脏超声图Note. A,Sham-operated group.B,4 weeks after TAC.C,8 weeks after TAC.D,12 weeks after TAC.Figure 4 Cardiac ultrasound of sham group and different periods after operation

注：与假手术组(Sham)比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与TAC术后4周比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与TAC术后8 周比&P<0.05，&&P<0.01，&&&P<0.001。图5 TAC术后不同时期心脏超声检查的比较Note. Compared with the sham-operated group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the 4 weeks after TAC group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001. Compared with the 8 weeks after TAC group,&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001.Figure 5 Comparison of echocardiography in different periods after TAC

图6 假手术组和TAC术后不同时期心肌组织镜检Figure 6 Microscopic examination of myocardial tissue in sham-operated group and different periods after operation

随着社会老龄化的发展进程，各种心血管疾病高发，心率衰竭发病率逐年增高[13]。同时由于年轻人的不当作息，心力衰竭也在年轻一代高发，临床上对该疾病也展开了许多的研究，但心衰成因机制多样[14]，防治工作形势依然严峻，至今未有对各类心衰均治疗有效地理想的治疗方案。而在心衰治疗的研究上，构建具有代表性，与人类疾病接近的动物模型则是最坚实又关键的一步。现阶段，应用于临床上的小鼠心衰造模方法也有很多，化学类药物诱导和物理手术造模方法较为常用[5-7]。本实验采用改良的TAC法造模，是考虑到物理方法相对于药物诱导对小鼠生理功能的影响较小，实验成本小，且成功率高等优点[15]。同时，采用改良的非开胸式的TAC法，可以降低因手术造成的死亡率。但在整个操作过程中，仍需格外小心，在本实验中也出现了因操作误差导致小鼠的死亡的现象，故在操作时的专注认真也是造模成功的关键之处。需要注意的是，在操作时，须注意不破坏胸膜，否则会导致动物气胸死亡。缝合线结扎力度须适中，防止勒破主动脉弓。抽去垫针时要注意力度，以免主动脉弓破裂。缝合过程要尽可能小心，避免缝合针误伤肋间动脉导致小鼠出血过多死亡。

按照改良的TAC法构建小鼠心力衰竭模型，从心动超声成像，左心室质量指数，病理组织学检查等多个角度来综合评价心脏功能及心衰程度，多方位验证该方法是否可行。心超多项与心衰相关指数呈显著性差异，如左心室舒张期、收缩期前壁厚壁均显著性增厚，左室内径在术后12周也显著性增大，左心室质量增大，左心室质量指数显著性增加容积增大，说明在主动脉弓缩窄后，导致心室(舒张期或和收缩期)负荷过重，心室异常肥大；射血分数和短轴率显著性减小，均显示心肌收缩功能受损[16]。每搏输出量在术后4周增大，至术后12周开始降低，显示心脏在TAC术后12周开始功能衰退。同时心肌组织病理学检查结果明显可见心肌不同程度病变，且采用HE染色和Masson染色两种方法，互相补充，通过HE染色，观察心肌纤维的形态、排列[17]，Masson染色进一步观察心肌组织的胶原增生等组织异常变化[18]。综上，各角度共同验证实验采用TAC法建立的小鼠心衰模型成功，可进一步进行后续的实验，探究治疗心衰有效的治疗方案，造福于人类社会。