两种方法构建自发转移且便于观察的裸鼠原位肝癌模型

郭 平，许敏华，张晶晶，金小宝，李小波，马 艳

(广东药科大学 生物活性药物研究重点实验室，广州 510006)

原发性肝癌是目前常见的恶性肿瘤之一[1-2]。建立自发转移且便于观察的人肝癌裸鼠模型是研究人肝癌的发展规律的基础。复旦大学肝癌研究所建立的高转移人肝癌细胞系MHCC97H、HCCLM3以及高转移人肝细胞癌裸鼠模型等为肝癌治疗及转移复发研究提供了有效的手段，但这些模型不能连续、直观地观察原位肿瘤及肺和腹腔转移灶，定量也不够准确[3-4]。Yang等建立一种可用荧光蛋白监视的人肝细胞癌裸鼠模型，可通过活体荧光成像，无创诊断和监测小鼠体内肿瘤，但生物体内有些物质在受到激发光后也产生荧光，造成假阳性[5-6]。后有学者构建稳定表达荧光素酶基因Luc人肝癌细胞株建立裸鼠原位模型，可以体外实时监测活体动物体内肝脏肿瘤的生长情况，并能灵敏可靠地用于抗肿瘤治疗效果的评价，但未探讨肿瘤转移情况[7-11]。

本研究采用肝内细胞悬液移植法和肿瘤组织块移植法建立Luc-GFP标记的高转移性人肝癌细胞裸鼠原位肝癌模型，通过非侵袭性的生物发光成像技术和激发荧光成像技术，在活体水平观察两种方法建立的裸鼠原位肝癌模型肿瘤生长和转移情况，可监控肿瘤的生长、评价治疗效果以及肿瘤的转移。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级 BALB/c裸小鼠24只，6～8周龄，雄性，体重18～22 g，购于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2016-0002]。实验地点为广东药科大学实验动物中心[SYXK(粤)2016-0125]小鼠饲养在SPF条件下，动物实验程序批准号:IACUC-201805036，使用3R原则对待实验动物。

1.2 主要试剂与仪器

MEM培养基、胰酶消化液和澳洲胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司，荧光素酶底物-D-荧光素钾盐购自上海翊圣生物科技有限公司，pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro和psiCHECK-2载体由广州赛哲生物股份有限公司馈赠。人肝癌细胞株(HCCLM3)购自中国典型培养物保藏中心(武汉)，由本实验室保存。手术器械：手术剪、眼科弯镊、直镊，持针钳、缝合针(4×10)、7-0缝合线均购自广州速研究生物科技有限公司。主要仪器:荧光倒置相差显微镜CKX41FS购自日本Olympus公司，ATP荧光检测仪Systemsure plus购自美国Hygiena公司，化学发光图片分析系统Tanon5200购自上海天能公司，实时荧光定量PCR仪CFXTM购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PCR扩增Luc基因

根据载体上Luc基因序列和慢病毒表达载体上多克隆位点设计2条特异性引物P1、P2，以载体为模版，引物P1、P2扩增Luc基因序列。

1.3.2 构建pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro慢病毒重组表达载体

对PCR扩增的Luc基因产物进行双酶切，参照文献[12]，获得目的基因Luc，连接到相同酶切的慢病毒表达载体，构建重组表达载体pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro，经筛选、酶切鉴定后送去测序。

1.3.3 Luc-GFP标记的人肝癌细胞HCCLM3-Luc-GFP的构建及鉴定

人肝癌细胞株HCCLM3培养于含10% FBS的MEM培养基中，取对数生长期细胞接种，过夜后转染，加入总体积300 μL，含包装有重组表达载体病毒液及聚凝胺的培养基，5 h后补加入300 μL新鲜培养基以稀释聚凝胺，1 d后更换为600μL含病毒液的培养基，3d后观察细胞荧光发光情况。

向转染后的人肝癌细胞每2d更换含有嘌呤霉素的培养基进行细胞筛选并观察细胞形态及荧光发光情况，调整细胞密度为8×105 cell/ mL，进行倍比稀释获得4个梯度细胞数。分别将倍比稀释的细胞悬液各取200 μL并加入相同浓度的荧光素酶底物，观察细胞荧光发光情况。

1.3.4 裸鼠原位肝癌模型的构建

(1)细胞悬液注射法：细胞悬液注射法：取对数生长期的HCCLM3-Luc-GFP细胞，胰酶消化调整细胞密度为5×107 cell/ mL，将裸小鼠戊巴比妥溶液麻醉，沿左肋缘下方开腹，暴露出肝脏左叶，使用无菌微量进样器分别将10 μL、20 μL细胞悬液缓慢注射入肝脏，将肝脏轻送回腹腔，缝合腹壁关腹，每天定时观察裸小鼠的情况。

(2)肿瘤组织块植入法：皮下移植瘤的建立：将处于对数生长期的HCCLM3- Luc -GFP细胞，胰酶消化调整细胞密度为2×107 cell/mL，取100 μL细胞悬液接种于裸鼠右肢腋下。待皮下瘤有明显生长，无菌条件下分离皮下肿瘤块，在无菌生理盐水中切成 1 mm×1 mm×1 mm备用。瘤组织离体后30 min内植入裸鼠肝脏。

(3)肝原位肿瘤组织种植：将裸小鼠戊巴比妥腹腔注射麻醉。沿左肋缘下方开腹，暴露出肝脏左叶，用尖头眼科镊沿肝脏包膜刺一隧道，植入上述切好的肿瘤组织块，将肝脏轻送回腹腔，缝合腹壁关腹，每天定时观察裸小鼠的情况。

1.3.5 活体成像观察荷瘤裸鼠肿瘤生长情况

在裸小鼠原位肝癌植入后第1、2、3、4和 5周 ，按荷瘤裸鼠体重，腹腔注射相应体积的戊巴比妥麻醉剂及荧光素酶混悬，分别进行生物发光和绿色荧光下成像，检测荷瘤裸鼠肿瘤进展情况，根据发光的强弱比较两种方法构建的裸鼠原位肝癌模型以及不同发光技术的差异。

1.3.6 病理解剖观察荷瘤裸鼠肿瘤形态及肺转移情况

第7周成像结束后，戊巴比妥麻醉裸鼠，打开腹腔和胸腔，观察肝脏肿瘤组织的大体形态、生长浸润情况以及远处转移情况。取肺，用Bouin's液固定2 d后，无水乙醇浸泡洗脱12 h，观察肺转移灶。苏木素-伊红(HE)染色，镜下观察肝脏肿瘤和肺转移灶的病理情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 PCR扩增 Luc基因

如图1所示，有清晰的特异性目的条带，大小在1.6 kb～1.8 kb 之间，与理论值相符。

2.2 重组表达载体的鉴定

双酶切鉴定，得到2个片段(见图2)，Luc基因在1.6 kb～1.8 kb之间，慢病毒重组表达载体片段在7.0 kb～10.0 kb之间，酶切结果与预期相符。测序结果目的基因Luc无突变，重组表达载体构建成功。

注：M：Marker；1～4：P1、P2为引物扩增的Luc基因片段。图1 PCR扩增Luc基因电泳图Note. M, Marker. 1-4, amplified Luc gene fragment.Figure 1 PCR amplification of Luc gene electrophoresis

注: M1：Marker；M2： Marker；1～4：慢病毒重组表达载体、单酶切XbaⅠ、单酶切BamHⅠ、双酶切XbaⅠ和BamH 。图2 重组表达载体酶切鉴定图Note. M1,Marker.M2,Marker.1,Lentiviral recombinant expression vector without digestion 2,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by XbaⅠ. 3,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by BamHⅠ. 4,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by XbaⅠ and BamH.Figure 2 Identification of recombinant expression vector by enzyme digestion

2.3 pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro转染肝癌细胞后荧光鉴定

慢病毒转染人肝癌细胞后3 d，在倒置荧光显微镜白光下观察，在白光条件下转染与未转染的细胞形态没有明显差异，在激发光条件下观察，相比较于未转染，转染后的人肝癌细胞有明显绿色荧光且均匀的分布于整个细胞(见图3)。

2.4 阳性克隆细胞株荧光素酶活性分析

将嘌呤霉素抗性筛选后的HCCLM3-Luc-GFP，梯度稀释后加入相同浓度荧光素酶底物，进行荧光素酶活性检测。结果显示(见表1)，转染组荧光相比较于未转染组荧光值明显提高，并且随着细胞密度数量的增加荧光值也会增加。

2.5 细胞悬液注射法构建裸鼠肝癌模型的活体成像观察

HCCLM3-Luc-GFP细胞在裸鼠肝内接种(见图4)后的第1周即可通过活体成像系统检测到生物发光信号，随着时间的延长，荧光信号逐渐增强，在接种后第5 周荧光信号达到最强，细胞接种量为10 μL第3 周有远处转移、细胞接种量为20 μL第1 周有远处转移(见图5)。

表1 细胞荧光素酶活性测定

注：未转染与转染比较，*P<0.05。

Note. Compared with no-transfection,*P< 0.05.

图4 肝癌细胞悬液法原位移植瘤的手术过程Figure 4 Surgical procedure of establishing liver cancer by liver cancer cell suspension method

注：A：Luc生物发光检测；B：GFP绿色荧光检测。图5 细胞悬液接种法的活体成像Note. A, Luc bioluminescence detection；B, GFP green fluorescence detection.Figure 5 In vivo imaging of cell suspension inoculation

2.6 肿瘤组织块植入法构建裸鼠肝癌模型的活体成像观察

HCCLM3-Luc-GFP细胞注射到裸鼠腋下皮下，可见明显皮丘，约10 d左右见瘤体生长，待瘤体直径至6 mm时，取肿瘤组织进行肝原位种植(见图6)。应用Tanon 5200 MμLti 动物活体成像系统检测荷瘤裸鼠肿瘤动态变化，接种后的第2 周于种植部位可见生物发光信号随着时间的延长即肿瘤的生长而逐渐增强，然而GFP标记在肝原位发光不明显(见图7)。

2.7 肿瘤组织实体观察

肝原位肿瘤生长5周后，处死裸小鼠，解剖暴露肝，发现两种方法肝上都有质地较硬颜色灰白色的肿瘤组织，如图8A所示：肝脏表面有多个病灶且体积小，肿瘤块均匀分布于肝，图8B所示肝脏表面病灶单一且体积大，几乎覆盖于整个肝，肿瘤聚集生长不能渗透于整个肝。肺组织颜色发现，黄色的肺组织中有白色肿瘤转移灶见图8C，图9 HE染色结果显示，肝脏原位肿瘤和肺转移可见肿瘤结节。

3 讨论

裸鼠原位肝癌模型一直以来都是肝癌研究领域的重要工具，对于肝癌发生、转移机制研究及抗肝癌新途径的探索都具有重要的应用价值[13-14]。目前，构建裸鼠原位肝癌模型的方法主要有肿瘤组织块植入法和细胞混悬液接种法[15-16]，但是这些方法都有各自的优缺点。本文通过两种不同的方法成功构建肝原位模型，并且成瘤率均为100%，但组织块接种法只在肝种植部位局部生长；而细胞悬液法则整叶肝都能成瘤，且有明显的肝外转移，可能细胞容易扩散，更能模拟出肿瘤生长的微环境。本课题组在模型构建中，发现50 μL细胞体积大，肝容易破裂、部分细胞悬液溢出；建议尽量提高细胞浓度，减少注射体积，可减少肝损伤，避免肿瘤腹腔内广泛种植。

本文研究了细胞悬液注射法和肿瘤组织块植入法两种方法建立的高转移性人肝癌细胞裸鼠原位肝癌模型肿瘤生长和转移情况，比较了绿色荧光蛋白[17-18]和荧光素酶[19-20]在裸鼠原位肝癌模型中的活体成像效果的差异，本实验选用了绿色荧光蛋白和荧光素酶作为报告基因，同时用于分子成像，综合了两者优势的同时弥补了彼此的不足，为以后研究者在选择构建便于活体观察且高转移的人肝癌裸鼠模型方面提供了帮助。

图6 肝癌肿瘤组织块法移植瘤的手术过程Figure 6 Surgical procedure of tumor tissue transplantation method for establishing liver cancer

注：A：Luc生物发光检测；B：GFP绿色荧光检测。图7 肿瘤组织块法的活体成像Note. A， Luc bioluminescence detection.B, GFP green fluorescence detection.Figure 7 In vivo imaging of tumor tissue transplantation method

注：A:细胞悬液法种植肝原位肿瘤; B:肿瘤组织块法种植肝原位肿瘤;C:Bouin’s染色后的组织。图8 肿瘤实体观察Note. A, Establishment of liver cancer by liver cancer cell suspension. B, Establishment of liver cancer by tumor tissue transplantation. C, Bouin’s stained lung tissue.Figure 8 Observation of tumor entities

注：A肝脏原位肿瘤; B肝脏肿瘤的肺转移。图9 肿瘤HE染色Note. A，liver tumor in situ. B,pulmonary metastasis of liver tumors.Figure 9 Tumor HE staining