高温米糠粕中蛋白质的提取工艺优化

杨华，宣丽*，权志中，杨宁，梁丽萍，宗绪岩

（1.沈阳市现代农业研发服务中心<沈阳市农业科学院>，辽宁 沈阳 110025；2.沈阳市康普利德生物科技有限公司，辽宁 沈阳 110161；3.辽宁康普利德生物科技有限公司，辽宁 铁岭 112600；4.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000）

米糠是指糙米碾下的皮层，蛋白质含量一般在12%～15%[1]。米糠粕是米糠经浸出、脱脂处理后的产物，蛋白含量在15%以上，通过加热膨化、浸取油脂处理可以在保留米糠营养特性、灭活抗营养因子的同时延长保质期[2]。因此，米糠粕更适合作为综合开发利用的原料。高温米糠粕是米糠经过高温提油之后的副产品。目前世界上每年生产米糠油50 万t，中小企业生产米糠油时采用高温提油工艺，而且米糠容易氧化酸败，在4～6 h 内必须进行加工达到热稳定化，因此市面上大部分的米糠粕属于高温粕[3]。

米糠粕在热稳定化加工过程中蛋白质容易发生变性，导致可溶性蛋白减少，给米糠蛋白的提取带来困难。国内外已有大量关于米糠深加工的研究报道[4]，例如从米糠中直接提取功能性物质制备功能性食品、利用微生物发酵米糠实现其增值转化，但鲜有关于高温米糠粕综合利用的研究。目前，米糠蛋白的提取方法主要有碱法、物理法、酶法以及物理法结合酶法[5]。其中，碱法提取是公认的工艺简便、提取率较高的一种方法[6]。超声波提取法具有提取效率高、操作方便、温度低、提取时间短等优点[7]。酶法反应条件温和、蛋白提取得率较高，且能更多地保留蛋白质的营养价值[5]。马永强等[8]的研究表明，碱性蛋白酶对高温米糠粕的水解效果较为突出；李东锐等[9]研究发现，超声波处理有助于米糠粕中米糠蛋白的提取，超声功率的变化对米糠蛋白的提取率影响不大，而超声处理时间影响相对较大，处理20 min 时蛋白提取率达到最大。

前期试验通过各活性物质提取顺序的研究，确定了适宜高温米糠粕综合利用的工艺顺序，即提取植酸钙→糖化酶除淀粉→提取蛋白质→提取多糖。此工艺顺序不仅最大程度避免了各活性物质间的相互影响，而且提高了蛋白质和多糖的质量[10]。本试验以提取植酸钙、除淀粉后的高温米糠粕为原料，分别采用碱法、碱法-物理法（超声波）、碱法-物理法-酶法（超声波+碱性蛋白酶）三种方法提取蛋白质，以期在相对温和的反应条件下优化蛋白质的提取工艺，从而为高温米糠粕的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠粕：采购于沈阳金稻饲料有限公司。

硫酸铜、硫酸钾、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、硼酸、糖化酶、碱性蛋白酶（活力2.0×105U/g）、浓硫酸、浓盐酸、碘、碘化钾、氢氧化钠等试剂，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HJ-M6 型水循环磁力搅拌水浴锅，金坛市城西春兰实验仪器厂；STARTER 3100 型pH 计，上海奥豪斯仪器有限公司；CP 214 型电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；K9860 型全自动凯氏定氮仪，海能仪器；SC-3614 型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；101FA-0 型电热鼓风干燥箱，上海树立仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米糠粕前处理

（1）提取植酸钙

按照料液比1：10（g：mL），在室温下提取1 h，提取溶剂为1 mol/L 盐酸，对米糠粕进行处理。提取结束后，离心，沉淀备用。

（2）糖化酶除淀粉

将1.3.1（1）中的沉淀，按照糖化酶添加量2%（糖化酶质量/米糠粕原料质量），料液比1：10（按米糠粕原料的质量计），温度60 ℃，pH 4.0～4.5，酶解4 h 进行处理，灭酶，离心，沉淀备用。

1.3.2 米糠粕蛋白提取

（1）米糠粕蛋白碱法提取

1.3.1（2）中的沉淀→按照料液比1：10（按米糠粕原料的质量计）加入蒸馏水→调节适当pH→水浴温度50 ℃，搅拌时间2 h→4 000 r/min 离心10 min，所得上清液处理方式分为步骤①②。

步骤①上清液用1 mol/L 盐酸调pH 为3.6[8]→静置过夜→10 000 r/min 离心10 min→取沉淀物→干燥。

步骤②沉淀物继续在料液比为1：10 的水中、适当的pH 值温度50 ℃条件下，2 h 分别提取2 次、3 次→4 000 r/min 离心10 min →上清液处理方法同步骤①。

（2）米糠粕蛋白不同提取方法的比较

碱法：料液比1：10，pH 值为11，提取温度50 ℃，提取时间4 h。

碱法+超声波：料液比1：10，pH 值为11，超声功率60 W，超声时间20 min，超声提取结束后，水浴提取温度50℃，提取时间4 h。

碱法+超声波+碱性蛋白酶：料液比1：10，pH 值为11，超声功率60 W，超声时间20 min，超声提取结束后采用酶法提取，碱性蛋白酶添加量2.5%，提取温度50 ℃，提取时间4 h。

提取结束后，灭酶，离心，上清液用1 mol/L 的盐酸调整pH 为3.6，静置过夜，沉淀离心后干燥，即得蛋白质样品。

1.3.3 碱法+超声波+碱性蛋白酶提取米糠蛋白的单因素试验

在研究中发现，米糠粕具有较强的pH 缓冲作用，另外随着酶解作用的进行，样品pH 值也会发生变化，所以本试验以酶解反应结束后，蛋白提取液的pH 值作为监测指标，研究不同酶解工艺对米糠蛋白提取效果的影响。

（1）碱性蛋白酶添加量对米糠蛋白得率的影响

精确称取50.0 g 米糠粕若干份，首先按照1.3.1 项进行前处理，离心后的沉淀分别加入500 mL 蒸馏水，用10%氢氧化钠调样品pH 值为11，超声功率60 W，超声时间20 min，超声提取结束后进行酶法提取，碱性蛋白酶添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，温度50 ℃，提取时间3 h。提取结束后，灭酶，离心，上清液测定pH 值，然后用1 mol/L 盐酸调pH 为3.6，静置过夜，沉淀离心后干燥，即得蛋白质样品，然后计算蛋白质得率。

（2）碱性蛋白酶酶解时间对米糠蛋白得率的影响

碱性蛋白酶添加量为1.5%，温度50 ℃，提取时间分别为1、2、3 h。采用碱法+超声波+碱性蛋白酶提取米糠蛋白，即得蛋白质样品，然后计算蛋白质得率。

（3）酶解结束后pH 值对米糠蛋白得率的影响

精确称取50.0 g 米糠粕若干份，首先按照1.3.1 项进行前处理，离心后的沉淀分别加入500 mL 蒸馏水，样品pH 值在碱性范围内呈现梯度，以保证酶解后pH 值分别为7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，超声功率60 W，超声时间20 min，超声提取结束后酶法提取，碱性蛋白酶添加量1.5%，提取温度50 ℃，提取时间1 h。提取结束后，灭酶，离心，上清液测定pH 值，然后用1 mol/L 盐酸调pH 为3.6，静置过夜，沉淀离心后干燥，即得蛋白质样品，然后计算蛋白质得率。

1.3.4 碱法+超声波+碱性蛋白酶提取米糠蛋白的正交试验

在单因素试验的基础上，进行L9(33)正交试验，试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

1.3.5 米糠蛋白的测定方法

采用GB5009.5《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定米糠蛋白样品中蛋白质的含量。按照公式（1）计算蛋白质得率，按照公式（2）计算蛋白提取率。

表2 pH 和提取次数对米糠蛋白得率的影响Table 2 The effect of pH and extraction time on the yield of rice bran protein

式中：m1为蛋白质样品质量，g；m2为原料质量，g。

式中：m3为米糠蛋白样品得率，%；m4为米糠蛋白样品的蛋白含量，%。

1.3.6 数据分析及处理

使用IBM SPSS Statistics 20 软件分析和处理数据。

2 结果与分析

2.1 米糠粕蛋白碱法提取

由表2 可以看出，pH 对米糠蛋白提取有较大影响。pH 值为8 时，第1 次提取，得率仅为0.12%；pH 值为9时，第1 次提取，得率提高到0.58%；pH 值为10 时，第1次提取，得率提高到1.28%，超过了pH 值为8 时3 次提取的蛋白得率总和；pH 值为11 时第1 次提取，得率提高到1.83%，超过了pH 值为9 时3 次提取的蛋白得率总和。因此后续试验选择pH 值为11。

可见，通过增加提取次数和调整pH 值，也仅使米糠蛋白的得率从0.12%提高到2.90%，考虑到增加提取次数会大量增加生产成本，降低提取效率，而且对于经热稳定化浸提米糠油的糠粕，碱法的提取效率也会大打折扣[11]，所以对高温米糠粕进行不同提取技术的复合处理很有必要。

2.2 米糠粕蛋白不同提取方法的比较

由表3 可以看出，超声波辅助碱法提取较碱法提取，蛋白得率提高了0.22%，碱法+超声波+碱性蛋白酶较碱法提取，蛋白得率提高了2.00%。虽然碱法+超声波+碱性蛋白酶提取的蛋白含量有所下降，但蛋白提取率还是高于碱法0.61%、高于碱法+超声波法0.48%。故高温米糠粕综合利用研究中，蛋白质的提取方法选择碱法+超声波+碱性蛋白酶法。

表3 不同提取方法对米糠蛋白提取效果的影响Table 3 The effect of extraction methods on the yield of rice bran protein

2.3 碱法+超声波+碱性蛋白酶提取米糠蛋白的单因素试验

2.3.1 碱性蛋白酶添加量对米糠蛋白得率的影响

由图1 可以看出，蛋白得率一方面和碱性蛋白酶的添加量有关，另一方面和酶解反应结束后的pH 值有关。酶解反应结束后的pH 值越低，蛋白得率相对越低，当碱性蛋白酶添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%时，蛋白得率相对较高，因此，选择这三个水平进行正交试验。

2.3.2 碱性蛋白酶酶解时间对米糠蛋白得率的影响

由图2 可以看出，随着酶解时间的延长，蛋白得率先升高后下降，在酶解时间为2 h 时，蛋白得率最高，为4.31%，而酶解后pH 值随着酶解时间的延长呈现下降趋势，因此，选择碱性蛋白酶的最佳酶解时间为2 h。

2.3.3 酶解结束后pH 值对米糠蛋白得率的影响

图3 显示了酶解结束后不同pH 值对米糠蛋白得率和含量的影响。由图3 可以看出，酶解反应结束后，蛋白提取液的pH 值越高，蛋白得率越高，蛋白含量也越高。随着pH 值从7.5 增加到11.5，蛋白得率从2.56%提高到6.16%，蛋白含量从57.5%提高到70.0%。虽然随着酶解后pH 的增加，蛋白得率一直呈现上升趋势，但碱液浓度过高，蛋白质中赖氨酸与丙氨酸、胱氨酸易发生缩合反应，生成有毒化合物，使赖氨酸营养价值大幅降低[5]。为了兼顾蛋白得率和营养，选择酶解后pH 值10.5、11.0、11.5 这三个水平进行正交试验。

2.4 碱法+超声波+碱性蛋白酶提取米糠蛋白正交试验

在单因素试验的基础上，进行正交试验，结果见表4，方差分析结果见表5。

从表4、5 中的数据分析可知，三个因素均是影响米糠蛋白得率的极显著因素，影响顺序依次为酶解时间>蛋白酶添加量>酶解后pH 值；提取米糠蛋白的最佳条件是A2B1C2，即蛋白酶添加量1.5%、酶解时间1 h、酶解后pH 值11.0。经验证试验，该条件下得到的米糠蛋白得率为7.10%，高于其他试验组；此时蛋白含量为70.5%。本试验通过工艺优化，使米糠蛋白在获得高得率的同时保证了较高的蛋白含量。

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal test

表5 正交试验方差分析Table 5 The variance analysis of orthogonal test

3 讨论

高温米糠粕中的可溶性蛋白比例较低，其氮溶解指数（Nitrogen soluble index，NSI）仅为11.6%，属高变性蛋白[12]。在本研究中也发现米糠蛋白未优化提取条件之前，得率仅为0.12%，这限制了其工业化生产和应用。本文通过优化碱法+超声波+碱性蛋白酶的提取工艺，确定了高温米糠粕综合利用工艺中米糠蛋白的最优提取条件为碱性蛋白酶添加量1.5%、酶解时间1 h、酶解后pH 值11.0。三个因素均是影响米糠蛋白得率的极显著因素，影响顺序依次为酶解时间>蛋白酶添加量>酶解后pH 值。在此条件下，米糠蛋白得率为7.10%，蛋白含量为70.5%。

王丕新[13]通过考察欧美几个稻谷加工厂，以及日本、韩国等发达国家米糠蛋白制取的先进工艺，也整理出工业化米糠蛋白制取的工艺为两次碱液浸出，他提出，未来有望在米糠蛋白制取工艺方面，结合酶法和高温喷射蒸煮等更先进的技术方法来实现米糠蛋白的全面工业化制取。他还指出，工业化生产米糠蛋白的原料为低温脱脂米糠，限制了高温米糠粕的应用。本文的研究证实了碱法+超声波+碱性蛋白酶法提高高温米糠粕蛋白提取率的可行性。有研究表明，热稳定米糠粕蛋白经碱性蛋白酶酶解后，蛋白的溶解度、乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性均有所提高[14]。在此基础上，下一步需要确定不同提取工艺对米糠蛋白功能性的影响，从而为米糠蛋白的应用提供理论依据。