高效液相色谱-串联质谱法检测绿茶中硝苯地平

刘超，景赞，吕雪梅

（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）

茶叶作为中华民族的传统保健饮料，已经有四五千年的历史[1]。绿茶作为茶叶的一种，具有降血脂、抗衰老、瘦身降脂等功效，尤其是在夏季，更是除热解暑之良品，因而受到人们的喜爱。流行病学研究、临床干预试验和动物试验均证实，绿茶还有降血压的作用[2-4]。

高血压是心脑血管病最重要的危险因素[5]，硝苯地平作为一种治疗高血压的高效药物，被广泛应用在高血压等的临床治疗中。近两年，风险监测显示市面上陆续出现了添加硝苯地平等二氢吡啶类降血压药物的绿茶。目前，硝苯地平的检测方法研究主要集中在中药或保健品方面，主要有薄层色谱法[6]、高效液相色谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[8]等方法，目前还未发现绿茶中硝苯地平的权威检测方法。本试验建立了绿茶中硝苯地平的检测方法，为制定绿茶中硝苯地平检测的国家标准或行业标准等提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇，色谱纯，CAEQ-4-003302-4000，上海安谱实验科技股份有限公司；乙酸，色谱纯，CAEQ-4-014048-4000，上海安谱实验科技股份有限公司；硝苯地平，50 mg、99.50%，Lot：SM180412，Stanford Analytical Chemicals InC 生产。丙酮，色谱纯，CAS 编号为67-64-1，成都市科隆化学品有限公司；二氯甲烷，色谱纯，CAS 编号为75-09-2，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

CARB-NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL），WGCN6550，深圳普分科技有限公司；高效液相色谱-串联质谱仪，AB公司API3200；电子天平（精确度0.01 mg），德国赛多利斯集团BT25S；电子天平（精确度0.1 mg），德国赛多利斯集团BSA224S；固相萃取仪（ZGCQ-12D），上海梓桂仪器有限责任公司；高速离心机（TGL-16M），湖南湘仪集团；旋转蒸发仪（EV331），莱博泰克科技有限公司；氮吹仪（WD-12），杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）；流动相：A-乙腈，B-0.2%乙酸水溶液；梯度洗脱条件如表1 所示。流速：0.3 mL/min；进样体积：5 μL。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

1.4 质谱条件

DGU20A-API3200 质谱仪。扫描方式：ESI 正离子模式；毛细管电压：4.5 kV；离子源温度：450 ℃；气帘气：30 psi；碰撞气：5 psi；雾化气：30 psi；辅助气：3 psi。硝苯地平的质谱参数见表2。

表2 硝苯地平的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of nifedipine

1.5 标准曲线的配制

1.5.1 标准储备液的制备（0.4 mg/mL）

精密称取10 mg 硝苯地平至25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，冷藏保存。

1.5.2 标准中间溶液的制备（100 ng/mL）

吸取12.5 μL 的储备液至50 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.5.3 标准工作溶液的制备

精密称取6 份不含硝苯地平的绿茶1 g，置于50 mL塑料离心管中，分别加入10、20、40、80、100、200 μL 标准工作溶液，加入甲醇溶液10 mL，振荡5 min，超声提取15 min 后，以4 000 r/min 离心5 min，上清液转移至鸡心瓶中，残渣用10 mL 甲醇再提取1 次，上清液转移至上述鸡心瓶中，将上述上清液旋转蒸发至5 mL 左右。用10 mL 丙酮-二氯甲烷（3：1）以3 mL/min 速度活化CARB-NH2固相萃取柱（500 mg/3 mL），将上述5 mL 旋蒸液以1 mL/min 的速度过柱，用6 mL 丙酮-二氯甲烷洗脱小柱，接收全部洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1 mL，过0.22 μm 的有机相微孔滤膜，滤液待上机分析，配成1、2、4、8、10、20 ng/mL 的基质标准曲线。

1.6 样品制备

1.6.1 超声提取

精密称取粉碎的绿茶1 g 至50 mL 塑料离心管中，加入甲醇溶液10 mL，振荡5 min，超声（700 W）15 min后，以4 000 r/min 离心5 min，上清液转移至鸡心瓶中，残渣用10 mL 甲醇再提取1 次，上清液转移至上述鸡心瓶中，将上述上清液旋转蒸发至5 mL 左右。

1.6.2 净化

试验采用CARB-NH2作为去除色素的固相萃取柱[9]。用10 mL 丙酮-二氯甲烷（3：1）以3 mL/min 速度活化CARB-NH2固相萃取柱（500 mg/3 mL），将上述5 mL旋蒸液以1 mL/min 的速度过柱，用6 mL 丙酮-二氯甲烷洗脱小柱，接收全部洗脱液，氮吹仪吹干，甲醇定容至1 mL，过0.22 μm 的有机相微孔滤膜，滤液待上机分析。

1.7 方法学考察

1.7.1 检出限与定量限

用处理好的不含硝苯地平的空白样品溶液将1 ng/mL的标准工作液稀释至产生3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比（S/N）。此时所对应的浓度分别为仪器检出限和仪器定量限。

1.7.2 回收率与重复性

精密称取6 份粉碎后的绿茶各1 g，置于6 个50 mL塑料离心管中，分别加入20 μL 的硝苯地平中间液，按照1.6 样品制备的步骤，制成6 个2 ng/mL 的低水平质控样；按上述步骤分别制备成4 ng/mL 的中水平质控样、8 ng/mL 的高水平质控样[10]。

2 结果与分析

2.1 线性关系

由试验结果知，硝苯地平在1～20 ng/mL 的浓度范围内，回归方程为y=2 570x+1 690，线性相关系数为0.999 6，可见硝苯地平在上述浓度范围内线性关系良好。

2.2 检出限和定量限

按1.7.1 步骤进行处理，结果显示，硝苯地平的方法检出限为13.8 μg/kg，定量限为46.0 μg/kg。

2.3 回收率

表3 不同浓度下的硝苯地平回收率结果（n=6）Table 3 Recoveries of nifedipine at different concentration levels（n=6）

由表3 可以看出，硝苯地平在3 个水平上的回收率均在83.5%～89.6%之间。而在80%～110%之间，说明试验方法准确性满足要求；同时，相对标准偏差在1.16%～3.98%，均小于5%，表明该方法重复性良好。

3 结论

本研究针对茶叶中硝苯地平的非法添加情况建立了特异性强的液质联用法。此方法的方法学考察均符合要求，完全能满足绿茶中硝苯地平检测要求，为绿茶中硝苯地平的质量控制提供了理论参考，但绿茶中其它二氢吡啶类及复合二氢吡啶类降血压药物的检测仍需进一步研究。