4种检出限确定方法的讨论——以离子色谱法测定冬瓜中亚硝酸盐含量为例

◎ 张 林，方明强，唐浩文，陈 洁，郑卫东

（1.四川工商职业技术学院，四川 成都 611830；2.南溪公共检验检测中心，四川 宜宾 644100；3.宜宾市屏山县书楼镇农业技术综合服务中心，四川 宜宾 645350；4.四川凯乐食品检测有限公司，四川 成都 611730；5.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 611731）

1947 年，德国人H·Kaiser 首先提出检出限的概念[1]。随着分析方法和分析技术的发展，检出限的定义深入人心，计算表达方式呈现多样化，使用广泛。但国家标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）、国际理论与应用化学联合（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）和欧洲分析化学组织（Eurachem）等组织对检出限的定义和计算表达方法却不完全一致[2]。在我国更多采用IUPAC 的定义：“某一分析方法在给定的置信度条件下可从试样中检出待测物质的最小浓度或最小量”[3]。检出限是样品中可被（定性）检测，但无需准确定量的最低含量（或浓度），是在一定置信水平下，从统计学上与空白样品区分的最低浓度水平（或含量）[4]。检出限是一个统称，细分有仪器检出限、方法检出限、实验室检出限，也有学者认为还有样品检出限[5]。其中，仪器检出限和方法检出限是日常工作中使用频率较高、使用范围较广的两类。仪器检出限是仪器对目标分析物的最低可检测浓度或含量，反映了仪器本身对不同物质具有的灵敏度，一般取噪音的3 倍值。方法检出限是指采用某种分析方法能定性检出目标分析物的最低浓度，一般是通过样品空白添加目标分析物，经过样品处理的全部步骤，再上机检测。方法检出限能综合反映分析方法和分析仪器的灵敏度。

当实验室首次使用某种检测方法时，需对该方法进行验证或确认。方法验证是指针对要采用的标准方法或官方发布的方法，通过提供客观证据对规定要求已得到满足的证实，而方法确认是指针对要采用的非标准方法或非官方发布的方法，通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定[6]。方法验证或方法确认需要考察的性能特征至少应包括正确度、精密度、选择性、检出限、定量限、线性度（或其他校准模型）、范围、不确定度和耐用性[7]。实际工作中，化学分析工作者普遍认为，当目标组分含量在常量级别或以上，通常情况下可以不进行检出限的测定或计算，但当目标组分含量在痕量或超痕量时，必须进行检出限的测定或计算[8]。

实验室在进行检验方法验证或确认时，多数情况下选择一种检出限计算方法或一种检出限测试方法即可。但不同途径获得的检出限结果可能不同。本文以离子色谱法测定冬瓜中亚硝酸盐为例，用全程序空白法、加入标准目标分析物法、标准溶液稀释法和通过校准曲线计算检测能力法4种方法获得检出限，通过比较，探讨不同计算方法对检出限的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3种亚硝酸盐（NO2-）标准储备液（以NO2-计）均为国家有证标准物质：①编号GSB 04-2839-2011，批号188049-2，质量浓度1 000 μg·mL-1，扩展不确定度0.7%（k=2）。②编号GSB 05-1142-2000，批号103412，标准值100 mg·L-1，扩展不确定度2%（k=2）；③编号GBW（E）081223，证书号H1808271/011，批号180827，标准值1.000 g·L-1，扩展不确定度0.6% （k=2）。淋洗液为KOH 溶液，由美国Thermo 公司提供免试剂发生装置产生。

1.2 仪器与设备

ICS-1100 型离子色谱仪，配电导检测器和循环再生电解抑制器，美国Thermo。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

依据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）[9]第一法离子色谱法进行检测。检测原理为试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，采用相应的方法提取和净化，以氢氧化钾溶液为淋洗液，阴离子交换柱分离，电导检测器或紫外检测器检测。

1.3.2 样品前处理

称取冬瓜约5 g（精确至0.001 g，可适当调整试样的取样量，下同）置于150 mL 具塞锥形瓶中，加入80 mL 水、1 mL 1 mol·L-1氢氧化钾溶液，超声提取30 min，每隔5 min 振摇1 次，保持固相完全分散。于75 ℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，定量转移至100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10 000 r·min-1离心 15 min，取上清液备用。

1.3.3 校准曲线绘制

准确吸取亚硝酸盐标准储备液1.0 mL 于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得到NO2-标准中间液10 mg·L-1。将亚硝酸盐标准中间液再稀释 10 倍，得到标准使用液1 mg·L-1，再逐级稀释配制为 0 mg·L-1、0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.06 mg·L-1、 0.08 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.15 mg·L-1的标准工作溶液，每个浓度进样1次。以浓度与相应峰面积绘制校准曲线。

1.3.4 仪器条件

IonPac AG19 Analytical Column（50 mm×4 mm）保 护 柱，IonPac AS19 Analytical Column（250 mm× 4 mm）分离柱，AERS 500（4-mm）型抑制器；抑制电 流：174 mA；流速：1.0 mL·min-1；进样量：50 μL；柱 温：35 ℃；检测池温度35 ℃。梯度洗脱：6 mmol·L-1，30 min；70 mmol·L-1，5 min；6 mmol·L-1，5 min。淋洗时间：45 min，峰面积定量。

1.3.5 信噪比测定方法

将标准中间液逐渐稀释，配制为0.000 25 mg·L-1、0.000 50 mg·L-1、0.001 00 mg·L-13 个低浓度溶液，测定信噪比。

2 结果与分析

2.1 全程序空白法检出限结果

确定检出限时，应选用不含或含有低浓度目标组分的天然样本。此外，也可使用空白样本、含有低浓度目标组分的均匀检验物料[10]。为尽可能降低基质中亚硝酸盐含量，进行了基质选择预备实验。选取蛋白质含量较低且日常食用量较大的植物性食物检测其亚硝酸盐含量，通过对新鲜蔬菜冬瓜、藠头、黄瓜、白萝卜、胡萝卜（橙色）和莴笋头进行检测，发现冬瓜的亚硝酸盐含量最低，基质干扰最小。因此，选取冬瓜作为基质材料。

在不添加标准目标分析物的情况下，检测5 批次样品，每批次样品进行两次独立平行实验，根据全程序空白法考察方法检出限。由于该检测方法为离子色谱法测定亚硝酸盐，根据《生活饮用水标准检验方法 水质分析质量控制》（GB/T 5750.3—2006）[11]中的6.3.2.2 方法计算检出限。计算公式见式（1）和式（2），经查表得t0.05(5)=2.571，计算得检出限为 0.11 mg·kg-1，实验结果见表1。

表1 全程序空白法检测结果表（单位：mg·L-1）

式中：Swb为空白平行测定（批内）标准偏差；Xij为样品的测定值；i为批次；j为同一批次样品各个测定值；p为批数；n为样品平行数。

式中：DL为检出限，mg·kg-1；Swb为空白平行测定 （批内）标准偏差（n＜20）；tf为显著性水平为0.05 （单侧），自由度为f的t值；f为批内自由度，等于p(n-1)；p为批数；n为平行样品份数。

GB 5009.33—2016[9]中给出了离子色谱法测定亚硝酸盐的检出限为0.2 mg·kg-1。根据全程序空白法得到的方法检出限是0.11 mg·kg-1，该数据低于国家检测标准给出的检出限，但两个数据的数量级一致，同时也表明基质对目标分析测定有干扰，原因是冬瓜自身含有较低量的亚硝酸盐[12]。通过全程序空白法获得的检出限能综合反映基质、试剂、人员和设备等实验因素的影响，但该方法也有一定的局限性，即当检测基质不同时，工作量较大。

在实际检测工作中，也可用3 倍空白标准差作为检出限。在式（2）中约为7.3，该值远大于3，意味着按照式（2）计算得到的检出限比按照3 倍空白标准差计算得到的检出限高。由此可知，即使原始数据一样，计算方法不同也会导致结果不同，因此需综合考虑实验室实际情况及检测方法本身等多个因素，选择合适的计算方法。

2.2 加入标准目标分析物法检出限结果

结合冬瓜自身亚硝酸盐含量及干扰，设定本次实验添加亚硝酸盐浓度为0.030 mg·L-1、0.035 mg·L-1、 0.040 mg·L-1和0.045 mg·L-1。各浓度水平加0.10 mL，独立重复3 次，待测液检测1 次，检测结果见表2。

由表2 可知，添加量为0.003 0 mg·L-1的样品组的信噪比最低。考虑扣除冬瓜基质的影响后，预估添加量为0.003 0 mg·L-1的样品组实际的信噪比会更低。对此，实验人员进行了添加量分别为0.002 0 mg、 0.002 5 mg 的实验。结果表明0.002 0 mg 组的出峰情况接近空白组，根据添加标准物质的实验，经计算得出方法检出限为0.4 mg·kg-1。

表2 添加标准目标分析物法检测结果表

与检测方法给出的0.2 mg·kg-1的检出限相比，尽管浓度数量级是同一级别，但通过添加目标分析物实验获得的检出限明显偏高。实验人员分析，出现该情况的主要原因是受基质影响。冬瓜自身含有一定量的亚硝酸盐，当添加量很小时，增加的响应峰面积不明显，会导致检出限较高[13]。

2.3 稀释标准溶液法检出限结果

配制0.000 25 mg·L-1、0.000 50 mg·L-1、0.001 00 mg·L-13 个低浓度溶液，每个浓度水平设置3 次独立重复，待测液上机测定1 次，检测结果见表3。0.000 50 mg·L-1的待测液有1 次检测的信噪比小于3。0.001 00 mg·L-1待测液的3 个重复检测结果均满足信噪比要求，即每次检测都能明确识别检测信号。随着浓度的增大，0.002 50 mg·L-1、0.005 00 mg·L-1两个浓度水平的信噪比显著增大。通过稀释标准溶液法计算得到的检出限是0.02 mg·kg-1，低于检测标准中给出的检出限。对标准溶液进行稀释，避免了基质及处理环节的影响，得到的检出限数值上更接近仪器检出限，也往往会低于方法检出限的数值。

表3 稀释标准溶液法检测结果表

2.4 通过校准直线计算检测能力法检出限结果

根据前期实验结果，方法的线性范围确定为＞ 6 mg·L-1，结合实际检品，方法的工作范围确定为 0 ～4 mg·L-1[14]。因 此，设 定0 mg·L-1、0.8 mg·L-1、 1.6 mg·L-1、2.4 mg·L-1、3.2 mg·L-1和4.0 mg·L-1为 标准溶液各浓度点，每个浓度点准备3 个独立重复。检测结果见表4。

表4 校准直线计算检测能力法检测结果表

获得校准函数和校准直线后，应检验校准函数和校准直线的线性性能。本实验的3 条校准直线均通过检验，检验结果为各浓度点测定值无异常，校准直线通过0.000 3 原点，校准函数线性成立，可以使用[14]。根据ISO 11843-2，可通过校准直线计算检测能力，详细的计算公式参见ISO 11843-2 C3[15]。通过校准直线计算的检出限是0.12 mg·L-1。

通过计算获得检出限是很多实验室常规的做法。张光建[5]分享了利用Excel 计算检出限的方法，同时指出校准曲线的不同配制方法对应的检出限不同。对比多种方法获得的检出限结果，可以看出通过计算获得的检出限比通过添加实验实际测得的检出限低。有学者认为，通过长期积累数据，经统计学计算得到的检出限是最佳的检出限[14]。

3 结论与建议

（1）检出限获得的方式有空白检测结果标准偏差的倍数、信噪比法、逐步稀释法、仪器灵敏度法、方法分辨率法和检测能力计算法等。不同原理的检测方法得到的检出限结果也不同，如色谱类检测方法更多运用信噪比法，光谱类检测方法多运用空白检测结果标准差法[16]。用不同的方法可能会获得不同的结果，结果可能会有较大的差异。当可以尝试多种方法时，建议实验室采用多种方法获得检出限，并对结果进行比较，根据实验室对方法准确度的要求来确定合适的方法计算检出限。

（2）在食品分析领域，常涉及食品安全判定标准。可以预见，食品安全管控会越来越严格，针对不得检出或检出量在痕量水平的物质，在进行方法验证时，应特别注意检出限。当实验室的检出限高于判定标准，或高于检测方法给出的数值时，应查找原因，多方法尝试，以确保获得的检出限具有分析操作的现实意义。

（3）检出限测定或计算方法不同，获得的检出限结果可能存在较大的差异。此外，实验结果除与仪器信号、仪器噪音有关，还与样品基质、操作人员、试剂和测定条件有关。在方法验证还未成为检验检测实验室强制规定前，就有学者提出应统一检出限的计算方法[3]。笔者认为，随着分析仪器的升级、分析方法的创新，检出限的计算方法会变得更多样化。若检验检测方法标准在出版时，文本中明确给出检出限的测定过程或计算方法，将有利于方法验证和数据比较。