高效液相色谱法快速测定三种果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺残留量

吴丽，周书来

（1.乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000；2.乐山职业技术学院，四川乐山 614000）

食用农产品质量安全是食品安全的源头，也是从农田到餐桌的第一道防线。近年来，国家不断加大对食用农产品的抽检力度，“十三五”食品安全规划要求主要针对农药、兽药残留的食品检验量不低于每年2 份/千人。众多研究发现，影响果蔬类质量安全的因素主要有农药残留、重金属和食源性致病微生物等，其中农药残留问题最为突出，它不仅会给健康带来一定的风险，还可能会影响国际贸易[1-3]。

甲苯氟磺胺和苯氟磺胺均为广谱型杀菌剂，中等毒性，主要用于防治柑桔、葡萄、黄瓜等果蔬的真菌性病害。德国科学家发现甲苯氟磺胺的分解产物可转化为有毒物质亚硝胺，亚硝胺可对水资源产生污染，欧盟已经发布限令禁止使用甲苯氟磺胺类杀菌剂[4-5]。国际食品法典委员会也将二者列入了2015～2019 年农药评估优先列表[6]。现行国标规定了番茄、黄瓜、莴苣、草莓、葡萄等多种果蔬中苯氟磺胺和甲苯氟磺胺的残留限量，其指定的检测方法均为气相色谱-质谱联用法[7-9]，该法操作复杂、仪器普及率不高，且适用范围仅为苹果、柑桔、葡萄、甘蓝、芹菜和西红柿这6 种果蔬，未能涵盖所有对甲苯氟磺胺类和苯氟磺胺有限量要求的品种。目前也尚无采用高效液相色谱法对两者物质的残留量进行测定的研究[10-11]。本文采用改进后的QuEChERS 方法提取净化，将乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，以梯度洗脱的方式，采用实验室普及率较高的高效液相色谱（二极管阵列检测器）检测二者残留量。方法操作简便、快速、分离度好、结果准确，能很好地应用于黄瓜、葡萄和番茄等几种常见果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺残留的定量检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甲苯氟磺胺（99.32%）、苯氟磺胺（99.0%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；C18 粉、PSA 粉及石墨炭黑粉，Agela Technologies；乙腈（色谱纯），北京百灵威科技有限公司；无水氯化钠（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯，用前在500 ℃马弗炉内烘5 h，冷却后取出装瓶备用），成都市科龙华试剂厂。

番茄、黄瓜、葡萄鲜样，均为市售。

1.2 仪器与设备

小型高速粉碎机，永康市天祺盛世工贸有限公司；CP225D 电子天平，德国赛多利斯公司；TG-16 台式高速离心机，四川蜀科仪器有限公司；IKA T25 组织捣碎匀浆仪，江苏金坛市环宇科学仪器厂；UPT-Ⅱ-10T 超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；TU-1901 紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪，Thermo SCIENTIFIC。

1.3 混合标准品溶液的配制

精密称取甲苯氟磺胺标准品11.62 mg、苯氟磺胺标准品10.68 mg，置于同一个100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，即得混合标准品贮备溶液。

精密量取混合标准品贮备溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

1.4 样品前处理

分别取新鲜果蔬（番茄、黄瓜、葡萄）样品，粉碎均匀，称取10 g（精确至0.1 g）试样，置于50 mL 塑料离心管中，加入20 mL、1%甲酸-乙腈，加盖超声提取30 min，往离心管中加入4 g 无水氯化钠、5 g 无水硫酸镁，加盖振摇2 min，然后在组织捣碎匀浆仪上以15 000 r/min 匀浆提取1 min，再以5 000 r/min 离心5 min，准确移取10 mL 上清液于50 mL 离心管中，离心管中预先加入750 mg 无水硫酸镁、250 mgPSA、50 mgC18 和50 mgGCB，加盖涡旋振荡1 min，再以5 000 r/min 离心5 min，准确移取5.00 mL 上清液在50 ℃下氮气吹至近干，加入2.0 mL乙腈涡旋溶解残渣，经0.45 μm 有机微孔滤膜过滤，进行HPLC 分析。

1.5 色谱条件

色谱柱：德国MN MACHEREY-NAGEL C18 不锈钢柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相：A 为乙腈，B 为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～1.0 min，40%B；1.0～17.0 min，40%～20%B；17.0～23.0 min，20%～20%B；23.0～25.0 min，20%～40%B。流速：1.0 mL/min。柱温：30 ℃。进样体积：10 μL。检测波长：205 nm。外标峰面积法定量。

1.6 方法学考察

1.6.1 线性范围

分别准确移取混合标准品贮备溶液0、0.1、0.25、0.5、2.5、5 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得混合标准曲线溶液。经0.45 μm 有机微孔膜过滤后进行HPLC 分析，以浓度c（μg/mL）为横坐标，相应峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，考察线性范围。

1.6.2 方法检出限与定量限

精密量取混合对照品溶液，加溶剂稀释成系列浓度的溶液，按1.5 项下的色谱条件进样分析。以3 倍信噪比计算检出限，以10 倍信噪比计算定量限。

1.6.3 精密度

精密量取混合对照品溶液，按1.5 项下的色谱条件连续进样6 次，记录峰面积，计算相对标准偏差（n=6）。

1.6.4 回收率与重复性

准确称取粉碎黄瓜、番茄和葡萄阴性样品，分别添加甲苯氟磺胺和苯氟磺胺5.0、7.5、10 mg/kg 这三个低、中、高水平浓度的标准溶液，每个水平设置6 个平行，按1.4项的方法进行前处理，1.5 项的方法进样分析，考察回收率与重复性，计算回收率和相对标准偏差（n=6）。

2 结果与分析

2.1 波长的确定

目前尚无高效液相色谱法测定果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺残留量的相关报道，波长的确定无相关参考文献。现将甲苯氟磺胺和苯氟磺胺标准溶液进行190～800 nm 光谱扫描，结果见图1。由图1 可知，甲苯氟磺胺和苯氟磺胺在203、205 nm 处为波峰，响应值最大，因此选取205 nm 作为测定波长。

2.2 线性范围、方法检出限和定量限

方法的线性范围、方法检出限和定量限检测结果见表1。由表1 可知，甲苯氟磺胺在0～57.70 μg/mL 范围内线性关系良好，线性回归方程为A=0.471c-0.109 3（R2=0.999 9），检出限为12.6 μg/kg，定量限为41.9 μg/kg。苯氟磺胺在0～52.87 μg/mL 范围内线性关系良好，线性回归方程为A=0.420 8c-0.092 5（R2=0.999 9），检出限为15.1 μg/kg，定量限为50.2 μg/kg。

表1 线性范围和检出限Table 1 Linear range and detection limit

表2 阴性样品的加标回收率及其相对标准偏差（n=6）Table 2 Spiked recovery and RSD of the negative samples(n=6)

2.3 回收率与重复性

阴性样品及加标样品色谱图见图2（C）、图2（D），标准峰与杂质峰实现了很好的分离。各添加水平平均回收率结果如表2 所示，由表可知，甲苯氟磺胺平均回收率为86.46%～97.39%，相对标准偏差（RSD）为1.98%～4.21%；苯氟磺胺平均回收率为79.73%～91.52%，相对标准偏差（RSD）为1.68%～4.19%。该结果表明本试验所用方法的回收率与重复性均能满足测定要求。

2.4 精密度

经计算，该方法中甲苯氟磺胺精密度的RSD为0.9%，苯氟磺胺的RSD为0.6%，可见，该方法的精密度良好。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

根据甲苯氟磺胺和苯氟磺胺结构特点和相关资料，考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液两种常见流动相体系和洗脱方式对目标化合物的影响。结果显示，目标化合物在两种流动相体系中峰形均较好，但甲醇在205 nm 处有末端吸收，干扰较大。本文还考察了洗脱程序对目标化合物出峰的影响，在等度洗脱的条件下20 min 内不能洗脱出峰，最终确定采用乙腈－0.1%甲酸水溶液作为流动相，以梯度洗脱的方式进行分析，结果显示标准峰型对称、峰宽较窄，如图3 所示。

3.2 样品预处理条件的优化

参阅相关文献[12]，本文对提取溶剂乙腈和1%甲酸-乙腈（v/v）进行了考察。试验结果表明，以回收率为指标，1%甲酸-乙腈作为提取溶剂时对三种果蔬中目标化合物的回收率均高于以乙腈作为提取溶剂时的回收率，故选取1%甲酸-乙腈为提取溶剂。

本文测试的三种果蔬，其含水量、含酸量及含色素量均较高，根据样品特点采用QuEchERS 法对样品进行前处理。本试验对QuEchERS 法中的净化剂种类和用量组合进行了考察，使用的净化剂有无水硫酸镁、C18、PSA和GCB。无水硫酸镁主要去除提取溶剂中多余的水分；C18 主要去除基质中的脂肪和蜡状物；PSA 主要去除脂肪酸、有机酸、糖类和极性色素；GCB 主要去除色素，对一些含有芳香环的化合物也有影响。样品提取后再离心取上清液观察净化效果，同时考察回收率。结果表明，PSA 和GCB 用量较高时，均会降低回收率，组合用量较少时，提取液中杂质较多，导致杂峰多易干扰。最终确定吸附剂组合用量为750 mgMgSO4+50 mgC18+250 mgPSA+50 mgGCB，该组合对样品进行净化处理后，上清液澄清，略带色泽，化合物平均回收率在79%以上。

4 结论

QuEChERS 是检测机构大批量样品前处理的一种常用方法，主要应用于含水量较多的果蔬类样品基质，该法快速、简单、有效，实用价值高，多见于气相色谱法或气质色谱法检测果蔬样品的前处理[13-14]。近年来已有学者对其在高效液相色谱-质谱法检测中的应用进行了研究[15-17]。本文在此基础上，结合样品特性，对净化剂组合用量进行了适当调整，将QuEChERS 前处理技术与高效液相色谱法相结合，建立了一种测定葡萄、番茄、黄瓜中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺残留量的新方法。基于之前并无高效液相色谱法测定甲苯氟磺胺和苯氟磺胺残留量的相关报道，本研究对色谱条件进行了全面考察，以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，实现了对标准峰型的优化和与杂质峰的分离。该方法操作简便、灵敏度高、结果准确可靠，能很好地满足几种果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺残留量的分析检测。