不同防冻剂对翠玉梨幼果冻害的效果研究

马敏，张颜茹，张苏玲，张臻，樊进补，吴昌琦，刘志强，任雅倩，张绍铃 ，王利斌

（南京农业大学，江苏南京 210095）

梨（Pyrusspp.）是世界性的重要的落叶果树，我国是世界上最大的梨生产国，主要分布在河北、辽宁、山东、江苏等省。翠玉梨是一种早熟梨品种，品质好，营养价值高，深受消费者喜爱。梨树春季开花较早，经常遭遇晚霜危害[1]。我国地域广阔，农作物栽培面积广，每年平均霜冻危害面积达34 万hm2，最严重的年份达到77 万hm2，造成至少30 亿元的损失[2]。近年来，我国北方地区晚霜冻害尤其严重。一些春季开花早的果树经常遇到晚霜危害，轻者减产，重者绝收[3]。霜冻，又称为冻害，是指0 ℃或0 ℃以下的低温使植物组织内结冰引起的伤害[1]。霜冻的种类有多种，依据霜冻发生的季节，分为春季霜冻、秋季霜冻、冬季霜冻。其中，春季霜冻（俗称“倒春寒”）对果树危害最严重，因为此时果树多处于花期或幼果期，器官对低温的抵抗能力较弱[1,4]。冻害程度与植物的种类、器官、生育时期、生理状态等有很大的关系[1,5-6]。对果树而言，树势越弱或树体营养越不足，冻害越严重。霜冻强度愈大，持续时间愈长，受害程度也愈重[1]。相关研究表明，霜冻导致落花落果多是由于花和幼果细胞膜被破坏而引起的[3]。活性氧自由基包括羟自由基（·OH）、单线态氧（'O2）、H2O2、O2·-等与脂氧合酶（LOX）共同启动了膜质过氧化[3]。在正常植物细胞中存在酶促和非酶促抗氧化防御系统，使活性氧自由基保持在一定范围内，阻止其对细胞膜的攻击[7]。当植物体遇到低温胁迫时，活性氧快速积累，活性氧清除能力下降，膜脂过氧化加剧，使膜透性增加，细胞内含物大量流失导致细胞死亡[8]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂过氧化的最终产物，它是由体内活性氧自由基引发的不饱和脂肪酸降解而产生的[9]。MDA 的积累在一定程度上反映了体内活性氧自由基活动的状态。

多年来，国内外许多学者围绕果树冻害方面做了一些研究，但有关梨幼果冻害的研究相对较少。有学者发现，某些防冻剂可提高抗氧化酶活性，抑制花或幼果膜脂过氧化[1,3]。如李志军等[3]在黄金梨子房膨大期采用3 种防冻剂（天达2116、必博PBO 和碧护）处理低温胁迫下幼果膜脂过氧化，结果表明，天达2116 和必博PBO 处理对减轻梨幼果冻害的效果较好。但是该研究存在以下诸多缺陷：以带黄金梨幼果的枝条为试材，与植株相比，存在一定的差异；降温过程与实际生产实践存在一定的差距；防冻剂的用量也并未标明，缺乏试验验证。因此，试验结果对实践的指导意义有限。本研究以翠玉梨花后12 d 子房膨大期的幼果为试材，采用带幼果的植株（2 年生），模拟田间霜降过程，比较了不同防冻剂（必博PBO、天达2116、调环酸钙、SA、维生素E+丙三醇、脱落酸、6-BA、甜菜碱、脯氨酸、γ-氨基丁酸和壳聚糖）处理对幼果膜质过氧化的影响，并结合试验验证，筛选出可减轻翠玉梨幼果冻害的防冻剂，为预防和缓解果树晚霜冻害提供理论依据现实指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料翠玉于2017 年3 月20 日采自南京农业大学湖熟实验基地，树龄为2 年，果园土壤为沙壤土，管理水平较高。选择生长势一致的植株为试验树。

1.2 试验试剂及浓度

必博PBO 300 倍液：主要成分有稀效唑、细胞分裂素BA、生长素衍生物ORE 和增糖着色剂、早熟剂、膨大剂、防冻剂、防裂素、杀菌剂、光亮洁净剂以及10 多种微量元素，是一种功能较齐全的果树营养型生长调节剂。由四川省（农科院）月兰科技开发公司生产。

天达2116 1 000 倍液：主要成分为海洋生物活性物质、细胞膜稳态物质、诱导抗病物质，内含复合氨基低聚糖、有机质、微量元素等23 种成分，具有肥药双功能。在植物遭受霜冻后，有一定的修复作用。由山东天达生物制药股份有限公司生产。

50 mg/L 调环酸钙，南京亿迅生物科技有限公司；3.62 mmol/L 水杨酸（Salicylic acid，SA），麦克林；0.25%维生素E，麦克林；5%丙三醇，阿拉丁；18 mg/L 脱落酸，源叶生物；0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、10 mmol/L 甜菜碱、5 mmol/L 脯氨酸、10 mmol/Lγ-氨基丁酸、0.75%壳聚糖，均为源叶生物生产。

1.3 仪器与设备

JA1203 精密电子天平（10D101-150-0001-0500），上海良平仪器仪表有限公司；CT15RT 台式高速冷冻离心机，日立/Hitach；Tecan Infinite F200/M200 Molecular Devices型多功能酶标仪，瑞士/Tecan。

1.4 试验设置

1.4.1 霜冻时间对幼果膜脂过氧化的影响

授粉12 d 后，利用人工气候室模拟自然界的霜降过程——以4 ℃/h 的速度从15 ℃开始降温，在-2 ℃下维持0、1、2、3、4、5 h 后，分别在不同时间点取大小一致、位置不同的幼果测定MDA 含量。依据MDA-冻害时间变化曲线，选择MDA 含量提高40%左右的时间点作为低温处理时间。

人工气候室中具体的温度变化见图1。以4 ℃/h 的速度从15 ℃开始降温，在-2 ℃下维持3 h 后，再以5 ℃/h的速度升温至18 ℃并维持2 h，分别在不同时间点取大小较为一致、位置不同的幼果测定其中MDA 含量。

1.4.2 不同防冻剂的筛选

于授粉后10 d 即在幼果期，选择生长状况好的幼苗分别进行10 种化学防冻剂的喷施，连续喷施3 d，每次喷至雨淋状（500 mL），每种防冻剂设置3 棵，挂牌标明每棵树喷施的防冻剂种类和喷施时间对照树每天喷施500 mL 清水，2 d 后放入人工气候室进行低温处理。取大小一致、位置不同的幼果测定MDA 含量。

1.4.3 6-BA、SA 防冻效果验证

将试验1.4.2 选出来的防冻剂0.5 mg/L 6-BA、3.62 mmol/L SA 进行单独/组合喷施，喷至雨淋状（500 mL），以清水处理（CK）为对照，2 d 后放入人工气候室进行低温处理。取大小一致、位置不同的幼果测定MDA 含量。

1.4.4 次年进一步验证抗冻剂的效果

为了进一步验证试验1.4.3 的结果，次年于授粉后10 d 即幼果期喷施化学防冻剂，喷至雨淋状（500 mL），以清水处理（CK）为对照，2 d 后放入人工气候室进行低温处理。取大小一致、位置不同的幼果测定MDA 含量。

1.5 测定指标与方法

MAD 含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[10]。取0.5 g幼果样品，加5%三氯乙酸（TCA）5 mL，研磨后所得的研浆在3 000 r/min 下离心10 min。取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后于100 ℃水浴30 min，冷却后离心。分别测定上清液在450、532、600 nm处的吸光值。丙二醛浓度计算公式见式（1），再进一步计算出单位鲜重植物组织中MDA 含量。

MDA 浓度c/(nmol/L)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450（1）

1.6 统计分析

应用SPSS16.0 统计软件进行方差分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多重比较检验差异显著性，用Excel 软件制图。

2 结果与分析

2.1 霜冻时间对幼果膜脂过氧化的影响

有研究表明，霜冻导致的落花落果多是由于花和幼果细胞膜被破坏而引起的，活性氧自由基在这一过程中起重要作用[3]。低温胁迫下幼果MDA 含量的变化可直接反映出细胞膜被氧化的程度以及细胞膜的通透性。如图2 所示，低温胁迫起始时，翠玉梨幼果MDA 含量为4.02 nmol/g。随着低温处理时间的延长，MDA 含量逐渐增加。低温处理3 h 和5 h，幼果中MDA 含量分别为5.71 nmol/g和7.09 nmol/g；与低温胁迫起始时相比，分别显著提高了42.21%和极显著提高了76.56%。依据MDA-冻害时间变化趋势图，选择MDA 含量提高40%左右的时间点作为以下试验的低温处理时间，即低温处理时间定为3 h。

2.2 不同防冻剂对幼果冻害的效果

前人研究发现，防冻剂可有效减轻梨幼果的冻害[3]，不同防冻剂处理对减轻梨幼果膜脂过氧化伤害的效果见图3。由图可知，6-BA 和SA 处理的幼果中MDA 含量显著低于对照组（P<0.05），分别为5.490、5.537 mmol/L，冻害减轻了18.46%和17.78%，说明其可有效减轻翠玉梨幼果膜脂过氧化。调环酸钙、脯氨酸、天达2116、γ-氨基丁酸、壳聚糖、必博PBO、甜菜碱，维生素E+丙三醇处理对减轻果实冻害无明显效果。此外，维生素E+丙三醇反而加重了果实的冻害（P<0.05）。

2.3 不同防冻剂组合对幼果冻害的效果

将筛选出来6-BA 和SA 进行单独/组合喷施，并于低温处理后测定翠玉梨幼果MDA 含量，结果见图4。由图4 可知，6-BA、SA 及其组合处理均可显著抑制幼果中MDA 的增加（P<0.05）；其中，6-BA 结合SA 处理效果更好。低温处理3 h 后，6-BA+SA 处理组果实MDA 含量为5.143 nmol/g，与对照组相比，下降了20.14%。

2.4 6-BA+SA 组合对低温冻害效果的验证

为了进一步验证2.3 试验结果的可重复性，次年对筛选出来的0.5 mg/L 6-BA+3.62 mmol/L SA 做进一步的低温冻害试验，结果见图5。由图5 可知，低温胁迫后，对照组和6-BA+SA 处理组果实中MDA 含量分别为7.022、5.736 nmol/g，两者差异显著（P<0.05）。研究结果表明，0.5 mg/L 6-BA+3.62 mmol/L SA 可显著减轻翠玉梨幼果的冻害。

3 讨论

Cao 等[11]研究发现，随着低温胁迫时间的延长，果实中活性氧（H2O2和O2·-等）含量逐渐提高。李志军等[3]以黄金梨幼果为试材，研究发现随着低温胁迫时间延长，细胞膜的破坏程度越大，MDA 和相对电导率越高。

6-BA 是一种较活跃的细胞分裂素，也是农业和园艺生产上应用最广的细胞分裂素之一[12]。6-BA 可以促进细胞分裂、促进芽的分化、促进细胞扩大、延缓叶片衰老、提高植物的抗逆性等[12,13]。SA 是植物体内产生的一种简单酚类物质，在植物抵御病原菌入侵以及提高植物非生物胁迫的抗逆中有重要作用[14]。前人研究发现，外源6-BA或SA 处理均可显著提高植株/果实的抗寒能力[15-18]。

本研究与李志军等[3]的研究结果存在差异，分析原因可能是梨品种不一致，防冻剂的最适浓度也不尽相同。本研究表明，随着低温胁迫时间的延长，翠玉梨幼果膜脂过氧化程度逐渐增加；霜冻前采用0.5 mg/L 6-BA 或3.62 mmol/L SA 处理均可有效抑制膜脂过氧化，减轻幼果冻害。进一步对筛选出来的抗冻剂进行组合和验证发现，0.5 mg/L 6-BA+3.62 mmol/L SA 处理对减轻翠玉梨幼果冻害的效果最好。