CD4+ T淋巴细胞在IgA肾病中致病作用机制研究

唐余燕 贺海东 孙蔚倩 张栋梁 胡屏 徐旭东

201199 上海，复旦大学附属闵行医院(上海市闵行区中心医院)肾脏科

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，是导致尿毒症的常见病因之一。IgAN以IgA(或包含IgG)免疫复合物沉积于肾小球系膜区及毛细血管袢为病理特征[1-2]，近年的研究表明低糖基化的多聚IgA1被称为“致肾病IgA”，是IgAN的关键致病因子[3]，但机制迄今为止尚不清楚。研究表明，IgAN患者机体内低糖基化IgA1是由B细胞产生，而这一分泌IgA1的过程是由CD4+T细胞调节完成，因此CD4+T细胞失调可能导致B细胞产生过量的异常IgA1，沉积在肾小球，促发免疫系统紊乱，最终导致IgAN的发展[4]。CD4+T细胞在调节IgA1生成及IgAN的发展中起重要作用。本实验通过检测IgAN患者治疗前及治疗后1月外周血清的CD4+T淋巴细胞细胞因子，包括γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白介素(interleukin，IL)-4、IL-17、IL-21、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，并检测IgAN患者治疗前JAK/STAT信号通路各信号分子的表达水平。分析CD4+T淋巴细胞在IgAN中致病作用机制，为IgAN的治疗提供新的思路。

材料与方法

一、研究对象与实验材料

1.研究对象 选取2017年8月至2018年8月于复旦大学附属闵行医院肾脏科住院治疗且经首次肾活检证实为IgAN患者，纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)eGFR均≥60 mL·min-1·(1.73 m2)-1。排除标准：(1)既往接受过糖皮质激素、免疫抑制剂或肾移植治疗；(2)合并感染、肿瘤、妊娠等情况的患者。本研究共纳入45例IgAN患者作为IgAN组，另外纳入我院体检中心49例体检健康者作为健康对照组。以上受试者均签署知情同意书，并得到闵行区中心医院伦理委员会的批准(批件号：2018-批件-010-01K)。

2.实验材料 兔单克隆抗体JAK/STAT信号通路均购于Abcam公司；人淋巴细胞分离液购于sigma公司；PE标记的人IFN-γ及IL-4单克隆抗体，FITC标记的人CD8α及CD4单克隆抗体，PEcy5标记的抗人CD3单克隆抗体及抗人FOXP3染色试剂盒均购于eBioscience公司；佛波酯、莫能霉素和离子霉素均购于Sigma公司；细胞固定剂和破膜剂均购于Invitrogen公司；IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-21及TGF-β1测试剂盒均购于R&D公司；反转录试剂盒及Real time PCR试剂盒均购于北京天根公司。

二、方法

1.治疗 IgAN组患者均单用甲泼尼龙激素治疗，剂量为0.8 mg·kg-1·d-1。激素治疗的指征：经3～6个月有效的支持治疗(包括血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂、控制血压)，患者蛋白尿>1 g/d且eGFR>50 mL·min-1·(1.73 m2)-1。

2.标本留取 IgAN组于肾活检前留取外周血10 mL，健康对照组于体检时留取外周血10 mL，分离血清、单核细胞、淋巴细胞备用。IgAN组治疗1月后随访时再次留取外周血5 mL，分离血清备用。

3.淋巴细胞的制备 吸取5 mL血液与等量1640培养液混匀后，将混合液沿管壁渐渐加入到含有5 mL淋巴细胞分离液的离心管中(混合液∶淋巴细胞分离液=1∶2)，2 000 rpm离心30 min。吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入1640培养液6 mL，轻轻混匀，分别进行2次洗涤，弃上清液，加入2 mL 1640全培养基重悬细胞。

4.CD4+T淋巴细胞细胞因子检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测健康对照组和治疗前后IgAN组患者的CD4+T淋巴细胞细胞因子水平。分离制备外周血清，分别吸取标准品及血清各50 μL依次加入孔中，后每孔分别加入50 μL酶联亲和物，37℃温育60 min，弃孔内液体，采用稀释的洗涤液冲洗5遍，加入显色液，室温下避光反应15 min，后每孔加入终止液50 μL，使用酶标仪在450 nm测定吸光度值。通过标准曲线计算出IFN-γ、IL-4、L-17、IL-21及TGF-β1的水平。

5.CD4+T淋巴细胞比例检测 采用流式细胞仪检测健康对照组和治疗前IgAN组患者的CD4+T淋巴细胞比例。将分离得到的淋巴细胞以RPMI1640培养液调整至1×106/mL，取25 μg/mL佛波酯、1 μg/mL离子霉素和1.7 μg/mL莫能霉素加入培养液中，37℃、50 mL/L CO2孵育6 h；PBS洗涤2次后收集细胞，分四管(A、B、C、D)，A、B管分别加入CD3-PEcy5、FITC-CD8α抗体，C管加入CD4-FITC、PE-CD25抗体，D管加入同型对照抗体，避光孵育15 min；PBS洗涤2次，100 μL固定剂作用15 min，PBS洗涤后加入100 μL破膜剂作用5 min，A、B管直接加PE-IFN-γ及IL-4抗体，C管加入抗人APC-FOXP3抗体，D管加入同型对照抗体，室温避光孵育30 min；PBS洗涤2次后500 μL PBS重悬，流式细胞仪对细胞荧光强度进行检测分析。

6.RT-qPCR检测JAK/STAT信号通路信号分子mRNA表达 将制备得到的健康对照组和治疗前IgAN组患者单核细胞转移至2 mL无RNA酶EP管内，做好标记，离心1 500 g×5 min，弃去上清，用于提取RNA。逆转录合成cDNA参照RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录反应。Real-Time PCR扩增检测JAK/STAT信号通路各信号分子的表达水平，引物序列如表1所示。反应条件：预变性94℃ 120 s；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40个循环；每次在延伸阶段读取吸光值。各组细胞表达的信号分子水平以2-ΔΔCt值表示。

表1 RT-qPCR引物序列

7.Western blotting检测JAK/STAT信号通路信号分子蛋白表达 随机选择5个IgAN患者及3个健康者，将其分离得到单核细胞裂解，制备培养细胞蛋白样品，SDS-PAGE电泳后转膜至硝酸纤维素NC膜上，取出漂洗过的印迹膜，放入5%脱脂牛奶中封闭1 h，向封闭后的印迹膜加入TBST稀释后的一抗JAK、JAK3、STAT3、STAT5、STAT6(1∶1000)，4℃孵育过夜。第2天TBST洗膜5 min×3次，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Jackson1∶2000)室温孵育2 h。TBST洗膜10 min×3次。加入化学发光检测试剂(试剂A∶试剂B=1∶1)反应2 min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。

三、统计学分析

结 果

一、两组一般资料比较

IgAN组45例患者中，有男性22例，女性23例，平均年龄(35.1±6.1)岁，平均eGFR(91.2±12.6)mL·min-1·(1.73 m2)-1。健康对照组49例受试者中，有男性24例，女性25例，平均年龄(34.5±7.1)岁，平均eGFR(112.0±10.6)mL·min-1·(1.73 m2)-1。两组一般资料比较无显著差异(P>0.05)，具有可比性。

二、两组血清中CD4+ T淋巴细胞细胞因子水平比较

与健康对照组相比，治疗前IgAN组血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平显著高于健康对照组(P<0.05)；而IFN-γ水平与健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。激素治疗1月后，IgAN组平均24 h蛋白尿较治疗前显著降低[(1.49±0.15)g/24 hvs.(2.31±1.10)g/24 h，P<0.01]，平均Scr与治疗前比较差异无统计学意义[(106.0±45.6)μmol/Lvs.(110.2±59.9)μmol/L，P>0.05]。IgAN组血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平均显著低于治疗前(P<0.01)(图1)。提示IgAN患者存在CD4+T淋巴细胞免疫反应失调。

三、两组CD4+ T淋巴细胞分布比例比较

通过流式细胞术检测两组外周血中Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)、Treg(CD4+CD25+FOXP3+)的分布比例，发现IgAN患者外周血Th1占T细胞的百分比为(14.04±4.11)%，略少于健康对照组的(16.25±6.16)%，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)；Th2的占比为(2.57±0.72)%，显著高于健康对照组的(1.81±1.10)%，差异有统计学意义(P<0.05)。IgAN组Th1/Th2比值显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。IgAN组Treg的占比为(2.14±0.82)%，显著高于健康对照组的(1.59±0.53)%，差异有统计学意义(P<0.05)。提示IgA肾病患者体内存在CD4+T细胞失衡。(图2)

四、两组JAK/STAT信号通路信号分子mRNA表达比较

为分析IgAN患者CD4+T淋巴细胞免疫反应失调机制，本研究采用RT-qPCR检测JAK/STAT信号通路发现，与健康对照组相比，IgAN组JAK1、JAK3、STAT3和STAT6 mRNA表达水平显著上调，而STAT5 mRNA表达水平显著下调(P<0.05)。两组JAK2、TYK2、STAT1和STAT4 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。提示CD4+T细胞亚群失调可能参与IgAN患者的发病机制，与JAK/STAT信号通路表达失衡有关。

五、两组JAK/STAT信号通路信号分子蛋白表达比较

为了进一步验证IgAN患者JAK/STAT信号通路表达失衡，本研究随机选择5个IgAN患者及3个健康者，通过Western blot检测前述mRNA表达有差异信号分子的蛋白水平，结果发现，与健康对照组相比，IgAN组JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白表达水平显著上调(P<0.05)，而STAT5蛋白表达水平显著下调(P<0.05)(图4)，与RT-qPCR检测结果一致。

讨 论

IgAN是最常见的原发性肾小球疾病，是终末期肾病的重要病因之一。病理特征为肾小球系膜区以低糖基化IgA1聚合体为主的免疫复合物沉积，临床表现以血尿和(或)蛋白尿为主。研究表明IgAN是免疫复合物沉积引起的自身免疫性疾病。近年来研究发现IgA1铰链区异常糖基化在IgAN发生中具有重要的作用，这一结论已获得广泛认可[5]。因此，深入了解异常糖基化IgA1生成作用机制有助于寻找新的治疗手段。

CD4+T细胞在控制和消除一系列外来入侵的病原体中起着关键性作用，但当CD4+T细胞错误应答自身抗原时，不仅导致机体慢性感染状态，而且诱发过敏和自身免疫性疾病，如慢性乙型肝炎病毒感染、过敏性鼻炎、IgAN等[6]。根据特定的细胞因子，为适应机体的免疫状态，CD4+T细胞分化为功能各样的亚群，并各自具有这些特定细胞因子的免疫功能[7]。Th1细胞分泌促炎细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β，有助于细胞免疫反应介导的细胞内病原体的清除；Th2细胞分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，参与体液免疫介导的细胞外病原体的清除[8]；Treg主要通过细胞接触机制及分泌抗炎因子IL-10、TNF-β等发挥维持免疫稳态和免疫耐受的作用[9-11]。随着研究的进展，CD4+T细胞亚群类型在不断更新中。JAK/STAT信号通路参与机体多种调节反应，JAK激酶被激活后，可进一步活化其下游信号蛋白分子STAT，导致STAT同源或异源二聚体化，随后二聚体蛋白移位核内，与相应的靶基因启动子结合，控制目的蛋白的表达，对机体的免疫调控起着重要作用。JAK/STAT信号通路在CD4+T淋巴细胞分化中起关键作用[12]。

分化失衡的T细胞不仅导致机体慢性感染，且诱导各种自身免疫性疾病，如肾小球肾炎[13]。研究表明，IgAN患者机体内低糖基化IgA1是由B细胞产生，而这一分泌IgA1的过程是由CD4+T细胞调节完成。在IgAN患者机体内表现为Th1型免疫反应减弱，Th2型增强，这可能与IgA在肾脏沉积有关[14]。在IgA肾病的ddY小鼠模型中，在疾病的早期阶段表现出较强的Th1优势[15]。新诊断为IgAN患儿的尿沉渣中有较高的T-bet表达，并且与T-bet蛋白在肾活检组织染色阳性正相关[16]。同时，Th2型细胞因子IL-4在IgA铰链区糖基化和肾纤维化中发挥关键作用。另外Th1/Th2比例与IgA肾病患者蛋白尿和肾组织病理改变相关[17]。由于血液样本特定的细胞因子和CD4+T细胞相对稳定且易于检测，因此它们有可能被用作治疗和监测疾病的生物标记物。然而，迄今为止，CD4+T细胞亚群在IgAN发病机制中的作用及其作为新治疗靶点的潜在应用的研究文献较少。本研究发现IgAN患者Th2、Treg在T细胞中的占比显著高于健康对照组(P<0.05)，提示IgAN患者存在CD4+T细胞亚群紊乱。而CD4+T细胞亚群免疫紊乱可能参与IgAN发病机制。

本实验通过检测IgAN患者及激素治疗后1个月外周血清的CD4+T淋巴细胞细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-21、TGF-β1)的表达水平。结果发现IgAN组血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平高于健康对照组(P<0.05)；而IFN-γ水平与健康对照组比较差异无统计学意义。IgAN激素治疗1个月后，随访患者24 h尿蛋白定量较治疗前显著减少，外周血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平均显著低于治疗前(P<0.05)。以往的研究表明，IgAN严重肾功能不全患者的Th2细胞因子IL-4为高表达。同时，Th2细胞因子参与扁桃体和胃肠道黏膜处IgA异常糖链形成[18-19]。此外，Th2型细胞因子IL-4在控制IgAl铰链区糖基化和肾纤维化中发挥关键作用。另一项研究表明，与健康对照组相比，IgAN患者Thl7表达比例增加，细胞因子IL-17A和IL-21表达也升高，并且血清IL-17A表达与24 h尿蛋白相关，并且63例IgAN患者中有34例肾小管有IL-17A表达，与29例无IL-17A表达相比，这些患者肾功能下降，蛋白尿和肾小管间质损害更严重[20]。与本文研究结果相一致。

陈明喆等[21]研究发现橙皮苷对IgA肾病大鼠肾功能具有改善作用，其机理可能与提高抗氧化能力，降低STAT3蛋白的表达有关。为分析IgAN患者CD4+T淋巴细胞免疫反应失调机制，本研究采用RT-qPCRT及Western blot检测JAK/STAT通路发现，治疗前IgAN组JAK1、JAK3、STAT3和STAT6表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)，而STAT5表达水平显著低于正常对照组(P<0.05)。两组JAK2、TYK2、STAT1和STAT4表达水平比较无显著性差异，提示CD4+T细胞亚群失调可能参与IgAN患者的发病机制，与JAK/STAT信号通路表达失衡有关。

综上所述，CD4+T细胞亚群失调可能参与IgAN患者的发病，其机制与JAK/STAT信号通路表达失衡有关，因此，CD4+T细胞因子(IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21)可能成为治疗IgAN的新靶点和监测IgAN病情的无创生物标志物。但由于研究经费的原因，本实验收集标本量较少，观察时间尚短，希望能有更多类似试验进行较大规模的研究，为提高IgAN的预后开拓新方向。