杀螟丹与Pb对赤子爱胜蚓的联合毒性效应

高晨昕，朱艳，郭梦炜，陶婧，艾敏，殷鸿洋，赵远，肖娴,*

1. 常州大学环境与安全工程学院，常州 213000 2. 无锡职业技术学院，无锡 214000 3. 江苏龙衡环境科技有限公司，常州 213000

在实际环境中，污染物通常不以单一形式存在，而是以混合作用模式存在。由于污染物的种类或者来源不同，在共存时受环境因素影响容易产生联合毒性效应，严重危害环境[1]。当多种污染物共存时，不同污染物之间会对生物体吸收、代谢及其他生化反应产生复杂的影响。杀螟丹(cartap)是我国经常使用的一种中低毒农药[2-3]。它是一种沙蚕毒素类农药，广泛应用于水稻、蔬菜、茶树和早粮作物害虫的防治。铅(Pb)是对环境和人体伤害较大的重金属“五毒”之一，在土壤中具有难分解、易积累和伤害不可逆等特点，是生态环境和人体健康的潜在杀手[4-5]。然而，目前对杀螟丹和Pb复合污染毒性效应的相关研究还很缺乏。

针对复合污染常用的指示性生物主要有卤虫、发光细菌、大型蚤、藻类、斑马鱼和蚯蚓等[6-7]。相关研究证明，斑马鱼胚胎透明，活体状态下可进行病变观察，且大部分基因对应人类同源基因，是目前毒理和病理学领域理想的生物标志物[8]。丁克强等[9]的研究结果表明，发光细菌毒性测定方法可用于评价和测定污染土壤的毒性，是理想的生物标志物。目前，相关研究显示，重金属与农药的复合污染对生物体的生理生化指标有明显影响，指标变化可反映污染物对生物的毒性机制，指示土壤污染程度。刘文丽等[10]发现异丙甲草胺作用下，蚯蚓体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)响应不同，CAT所受影响更大。苏连水[11]在研究多菌灵等农药和镍复合污染对蚯蚓的毒性影响时发现，蚯蚓繁殖和生长能力均受不同程度损伤，CAT和SOD响应也不同。阎晓静[12]研究发现，吡虫啉和镉复合污染对蚯蚓体内丙二醛(MDA)含量有影响，对SOD和CAT活性有抑制作用。重金属与农药联合作用于生物体时产生的毒性作用与单一作用完全不同，并且多数表现为协同作用[13]。孟顺龙等[14]研究发现，灭多威和辛硫磷对罗非鱼分别属于极高毒和高毒，二元联合在96 h内为协同作用。吴淑杭等[15]的研究表明，甲氨基阿维菌素与阿维菌素联合作用毒性为两者单一作用毒性之和，二氯喹啉酸与莎稗磷的毒性互相促进。目前，复合污染尤其是同源污染，即同一环境介质中不同污染物构成的污染类型(例如重金属和农药)，造成的严峻的环境问题已逐步引起各国关注[16-17]。目前，关于复合污染的联合毒性研究主要集中在急性致死方面，而在亚致死剂量下对生物体机体的损伤方面的研究还甚少。

土壤中生物量最大的寡毛纲陆栖动物代表是蚯蚓。由于蚯蚓对污染物敏感度高，极易受到污染物的影响导致生存和遗传等多方面的变化，所以常被用作鉴别和诊断土壤污染，作为模式生物应用于生态毒理学[18]。为了探究重金属和农药对土壤生态的联合毒性，笔者选取赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)作为研究对象，研究杀螟丹和Pb单一及二元复合胁迫下蚯蚓的死亡率和生理生化指标的变化，为深入研究重金属与农药复合污染的作用机理提供研究方法和数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 受试生物

赤子爱胜蚓购置于江苏某蚯蚓养殖场。试验前经实验室预培养一段时间，试验过程中选择体型相似、体重约0.3 g的性成熟的成年蚯蚓。

1.2 蚯蚓急性毒性实验

1.2.1 单一毒性实验

蚯蚓清肠：在预先培养的蚯蚓中挑取性成熟的成年蚯蚓，洗净后吸干体表水分后放入烧杯中，烧杯底部铺有滤纸并加适量水润湿，用解剖针扎好孔的保鲜膜封口。将烧杯置于的恒温培养箱中，温度为(20±1) ℃，湿度约80%，于暗处清肠24 h。

暴露实验：依据预实验结果，对浓度区间进行等对数间距稀释形成5个浓度梯度进行正式实验。将双圈定性滤纸垫入玻璃培养皿中，准确吸取4 mL试验浓度的试剂均匀淋洒于滤纸上，已清肠的蚯蚓冲洗干净并吸干体表多余水分后在每个浓度处理中放入一条，每个试验处理组设10个重复，同时设置空白对照组。用保鲜膜封口扎紧，再将玻璃培养皿置于培养箱中，调节温度为(20±1) ℃，湿度为80%左右，于暗处培养72 h，并于24、48和72 h分别记录蚯蚓的中毒症状和死亡数。

1.2.2 联合毒性实验

根据《化学农药环境安全评价试验准则 第15部分：蚯蚓急性毒性实验》(GB/T 31270.15—2014)[19]中滤纸法的规定，以杀螟丹和Pb对蚯蚓的48 h的半致死浓度(LC50)值为一个毒性单位，按照等毒性比1∶1的混合比例以等对数间距设置试验浓度进行联合毒性实验，具体程序参照单一毒性实验的方法。

1.2.3 联合毒性效应评价

当前，在国际上并未确定统一的关于污染物对土壤动物的联合作用评价方法，本研究采用Marking相加指数法[20]评价重金属与农药复合污染对蚯蚓的联合毒性作用，计算方式如下：

(1)

(2)

S>1时，AI=1.0-S

(3)

式(1)中：An、Bn和Cn值分别代表混合物中不同毒物的LC50值，Aj、Bj和Cj分别代表A、B和C毒物单独作用时的LC50值。

依照相加指数(AI)值判断联合毒性的类型[21]，当-0.2

1.3 蚯蚓生理生化指标实验

分别采集不同时间各处理的蚯蚓样本，按照称取的蚯蚓质量的9倍加入0.86%的生理盐水，用匀浆器在冰浴条件下匀浆，用冷冻离心机将匀浆好的蚯蚓组织液在2 500 r·min-1条件下离心10 min。取上清液用生理盐水稀释成所需质量分数的组织匀浆，待测。

蚯蚓体内蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝蛋白测试盒(南京建成生物科技研究所)，试验设置空白管、标准管和测定管，其中，空白管中加入双蒸水，标准管中加入0.563 g·L-1的蛋白标准品，测定管中加入各处理的蚯蚓组织匀浆。试验时先加入样品，再加入考马斯亮蓝显色液，混匀静置10 min，用酶标仪(E7031，美国普洛麦格公司)在波长595 nm处测定各管的吸光度值(OD)。根据测得的OD计算蚯蚓样本2%浓度的组织匀浆液的蛋白含量[22]，计算方法如下：

SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，试剂盒购于南京建成生物科技研究所，试管设置测定管和对照管，测定管加样品，对照管加同样体积的双蒸水，室温静置10 min后，用酶标仪(E7031，美国普洛麦格公司)在波长550 nm处[23]，测定各管的吸光度值，SOD活性计算方法如下：

CAT活性采用可见光法测定，试剂盒购于南京建成生物科技研究所，试验设置对照管和测定管，按照试剂盒的说明进行操作。用酶标仪(E7031，美国普洛麦格公司)在波长405 nm处，测定各管的吸光度值[24]。计算方法如下：

(6)

MDA含量采用TBA法测定，试验设置空白管、标准管、测定管和对照管，按照试剂盒(南京建成生物科技研究所)说明进行操作，用酶标仪(E7031，美国普洛麦格公司)在波长405 nm处测定各管的吸光度值[25]。计算方法如下：

(7)

1.4 数据处理

利用Origin8.5软件对混合体系中各物质浓度与蚯蚓死亡率进行非线性拟合，并采用非线性回归方程计算得出蚯蚓的24、48和72 h的LC50值。

2 结果(Results)

2.1 杀螟丹和Pb对蚯蚓的急性毒性效应

2.1.1 杀螟丹和Pb对蚯蚓的单一毒性

蚯蚓经杀螟丹暴露后，出现一些中毒症状：躯体颜色加深且躯体极度延展、失去弹性，部分蚯蚓爬行缓慢，反应迟缓，对刺激不敏感。蚯蚓经Pb染毒后主要表现为：躯体变软、有小泡，出现“抱团”现象，染毒时间延长后，一些蚯蚓表皮渗出血液，有些个体出现躯体腐烂、变黑和断节现象。

杀螟丹和Pb对蚯蚓的单一毒性试验结果如表1所示。结果表明，2种药物对蚯蚓毒性有差异，并且毒性都随着暴露时间的延长而增强。染毒24 h时，杀螟丹对蚯蚓的单一毒性大于Pb，其24 h-LC50值为14.3 mg·L-1。蚯蚓对Pb的耐受能力更强，为杀螟丹的67.9倍。染毒48 h时，杀螟丹和Pb的48 h-LC50分别为12.4 mg·L-1和911.6 mg·L-1，毒性分别增强1.2倍和1.0倍，杀螟丹毒性更强，是Pb的73.8倍。染毒72 h时，杀螟丹和Pb单一毒性继续增强，较48 h增强1.2倍和1.1倍，杀螟丹72 h-LC50值为10.4 mg·L-1，毒性更强。

表1 杀螟丹和Pb对赤子爱胜蚓的单一毒性Table 1 The individual toxicity of cartap and Pb on Eisenia foetida

2.1.2 杀螟丹和Pb对蚯蚓的二元联合毒性

杀螟丹-Pb对蚯蚓的联合毒性作用类型结果如表2所示，杀螟丹与Pb等毒性1∶1配比、暴露24、48和72 h时，AI分别为-0.17、-0.19和-0.25，联合作用表现为相加作用、相加作用和拮抗作用，二者随着暴露时间的延长，相互作用逐渐减弱。二元混合体系下，杀螟丹和Pb的LC50几乎是各自单一作用时的1/2，且随着暴露时间延长，LC50值逐渐降低。在混合体系中，二者毒害性大于各自单一作用时产生的毒害，但随暴露时间的延长，联合作用逐渐减弱。

表2 杀螟丹-Pb二元混合体系对赤子爱胜蚓联合毒性评价结果Table 2 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cartap and Pb to Eisenia foetida

2.2 杀螟丹单一作用对蚯蚓体内生化指标的影响

设置杀螟丹染毒浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1，以不加杀螟丹为空白对照(CK)，分别在24、48和72 h采集蚯蚓样本进行前处理，测定其蛋白含量、体内SOD活性、CAT活性以及MDA含量，结果如图1所示。

图1 杀螟丹单一染毒24、48和72 h对蚯蚓体内蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影响Fig. 1 Effect of cartap on protein content, superoxide dismutase (SOD) activity, catalase (CAT) activity and malondialdehyde (MDA) content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

蚯蚓经不同浓度杀螟丹染毒后，蛋白含量在染毒时间内先升高后降低并趋于稳定(图1(a))。染毒24 h时，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1浓度组蛋白含量分别较CK增加12.9%、9.5%、43.6%、29.6%和23.8%，在浓度为1.5 mg·L-1时出现峰值。染毒48 h时，在浓度为1.0 mg·L-1时达到峰值。染毒72 h时，在浓度为1.5 mg·L-1时达到峰值。不同染毒时间内，峰值浓度组均与CK存在显著性差异(P<0.05)。暴露时间内，24、48和72 h内SOD活性分别呈现先降低后升高、先升高后降低和持续降低的趋势(图1(b))。暴露24 h时，各处理SOD活性分别高于CK 10.93%、3.02%、-2.06%、5.51%和19.04%。染毒48 h的SOD活性呈现与24 h相反趋势，在浓度为2.0 mg·L-1时达到峰值，随后降低。暴露72 h时SOD活性持续降低并远低于CK。24 h和48 h时各浓度组间SOD活性差异不显著，72 h时各浓度组之间以及与CK均存在显著性差异(P<0.05)。CAT活性在暴露时间内，整体呈现先上升后降低趋势(图1(c))。CK体内CAT活性无明显波动。染毒24 h时CAT活性被诱导迅速上升，并在0.5 mg·L-1时达到峰值。48 h时CAT活性在2.0 mg·L-1时达到峰值后大幅降低，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1浓度组与24 h相比分别降低52.18%、46.51%、41.24%、32.58%和40.37%。72 h时CAT活性相对48 h整体略升高，在1 mg·L-1时达到峰值。除72 h时各浓度组之间差异不显著，其余暴露时间不同浓度组之间均有显著性差异(P<0.05)。72 h内随着染毒时间的增加，蚯蚓体内MDA含量整体降低(图1(d))。CK中蚯蚓体内MDA含量较稳定，基本不变。染毒24 h时，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1浓度组的MDA含量分别高于CK 29.37%、66.87%、34.70%、14.77%和2.2%，并呈现先升高后降低趋势且在1.0 mg·L-1时达到峰值。染毒48 h时，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1浓度组中MDA含量分别高于CK 1.79%、15.83%、38.13%、5.45%和2.49%，整体含量较染毒初期降低。染毒72 h时，MDA含量基本与CK相当。除24 h和48 h内峰值浓度组与CK存在显著性差异(P<0.05)外，其他浓度组之间、与CK之间均无明显差异。

2.3 Pb单一作用对蚯蚓体内生化指标的影响

经50、100、150、200和250 mg·L-1Pb处理后，分别于24、48和72 h采集蚯蚓样本，进行蛋白含量、体内SOD活性、CAT活性和MDA含量的测定，结果如图2所示。

24、48和72 h暴露时间内，蚯蚓体内蛋白含量变化趋势相似(图2(a))。暴露24 h时，蛋白含量呈现升高、降低、升高趋势，50、100、150、200和250 mg·L-1浓度组相对CK分别增加11.25%、33.91%、22.82%、13.42%和21.55%，在浓度为100 mg·L-1时达到峰值，随后降低。染毒48 h的变化趋势与24 h相同。染毒72 h时，浓度≥100 mg·L-1时蛋白含量逐渐降低，在250 mg·L-1时降至与CK相当。不同时间段内，峰值浓度组均与CK存在显著性差异(P<0.05)。随着暴露时间延长，CK中蚯蚓体内SOD活性几乎稳定不变(图2(b))。染毒24 h时，各浓度组SOD活性均大于CK并呈现逐步升高趋势，50、100、150、200和250 mg·L-1浓度组分别较CK增加了5.06%、11.18%、21.48%、33.03%和40.37%，在250 mg·L-1时达到峰值。暴露48 h时SOD活性先升高后降低，在Pb浓度为100 mg·L-1时达到峰值，与CK相比升高50.90%。暴露72 h时SOD活性逐步降低并趋于平稳。除72 h内各浓度组间无显著性差异，其余暴露时间各浓度组间、与CK间均存在显著性差异(P<0.05)。CK中蚯蚓体内CAT活性随暴露时间延长无明显变化(图2(c))。染毒24 h时，CAT活性呈现降低、升高、降低趋势，在Pb浓度为200 mg·L-1时达到峰值，50、100、150、200和250 mg·L-1浓度组分别高于CK 48.75%、33.95%、46.99%、61.89%和44.82%。染毒48 h时，CAT活性整体大幅下降，甚至低于CK，各浓度组与CK均存在显著性差异(P<0.05)。染毒72 h时，CAT活性恢复至与CK相当并保持平稳。各浓度组之间均无显著性差异。随着暴露时间延长，CK中蚯蚓体内MDA含量变化幅度很小(图2(d))。染毒24 h和48 h时，MDA含量均呈现先降低后升高的趋势。24 h的最小值出现在浓度150 mg·L-1时，低于CK 11.83%，然后在200 mg·L-1和250 mg·L-1时分别高出CK 24.09%和37.44%。48 h时基本回落至CK水平。染毒72 h时，MDA含量逐步上升，整体较48 h略升高。3个不同时间段内，峰值浓度组均与CK存在显著性差异(P<0.05)。

图2 Pb单一染毒24、48和72 h对蚯蚓体内蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的影响Fig. 2 Effect of Pb on protein content, SOD activity, CAT activity and MDA content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

2.4 杀螟丹和Pb二元联合对蚯蚓体内生化指标的影响

经过0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的杀螟丹与50 mg·L-1Pb梯度处理24、48和72 h后采集蚯蚓样本，测定其体内蛋白含量、体内SOD活性、CAT活性以及MDA含量，结果如图3所示。

图3 杀螟丹与50 mg·L-1 Pb联合染毒24、48和72 h对蚯蚓体内蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的影响Fig. 3 Effect of cartap and Pb (50 mg·L-1) on protein content, SOD activity, CAT activity and MDA content of Eisenia foetida after exposure for 24, 48 and 72 h

24、48和72 h的暴露时间内，蚯蚓体内蛋白含量整体呈现升高、降低、升高、降低趋势(图3(a))。染毒24 h时，蛋白含量在1.0 mg·L-1杀螟丹与50 mg·L-1Pb联合染毒时达到峰值，与CK存在显著性差异(P<0.05)。染毒48 h时，蛋白含量呈现先降低后升高趋势，各浓度组均与CK存在显著性差异(P<0.05)。72 h时，蛋白含量呈现与48 h相反趋势，即随着暴露浓度的增加蛋白含量降低，与CK差异性也越显著。不同处理组蚯蚓体内SOD活性几乎均高于CK(图3(b))。CK的SOD活性在48 h时达到峰值。染毒24 h时，SOD活性呈现上升趋势，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1的杀螟丹+50 mg·L-1Pb组较CK升高10.70%、22.40%、32.53%、45.89%和54.54%，在杀螟丹(2.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组达到峰值。各浓度组之间、与CK均存在显著性差异(P<0.05)。染毒48 h时，SOD活性变化趋势同24 h，各浓度组之间差异不显著。染毒72 h时，SOD活性先升高后降低，峰值出现在杀螟丹(1.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组，各浓度组均与CK存在显著性差异(P<0.05)。CK中蚯蚓体内CAT活性随暴露时间增加无明显变化(图3(c))。染毒24 h时，CAT活性较CK大幅升高，并呈现先升高后降低趋势，在杀螟丹(2.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组达到峰值。染毒48 h时，CAT活性较24 h时大幅降低，杀螟丹(0.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组CAT活性低于CK，峰值出现在杀螟丹(1.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组，较24 h峰值降低24.97%。染毒72 h时，CAT活性较48 h升高，但不同浓度组CAT活性变化不大。除24 h各浓度组间存在显著性差异，其余染毒时间内差异均不显著。CK中蚯蚓体内MDA含量较稳定，随暴露时间增加无明显变化(图3(d))。染毒24 h时，低浓度组中MDA基本未受到诱导作用，在杀螟丹(1.0 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组中受到抑制。高浓度杀螟丹(2.0、50和2.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)处理组MDA受到的诱导作用较强，分别高于CK 31.91%和58.75%。染毒48 h时，MDA含量变化幅度较24 h更小，并呈先降低后升高趋势，其中，在杀螟丹(1.5 mg·L-1)+Pb(50 mg·L-1)浓度组中与CK相当。各浓度组之间无显著性差异。染毒72 h时，MDA含量整体升高，各浓度组之间以及与CK间均存在显著性差异(P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

笔者研究了农药杀螟丹与重金属Pb对蚯蚓单一和联合毒性效应，考察了亚致死剂量下蚯蚓体内蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的变化趋势，找出反映蚯蚓受污染物胁迫程度的生物学指标。

杀螟丹和Pb对蚯蚓的单一毒性研究结果表明，杀螟丹毒性大于Pb。这可能由于杀螟丹具有神经性杀虫活性，尤其对土壤生物具有较大杀伤力，毒害作用高于土壤中富集的重金属[26]。而蚯蚓对不同重金属的耐受性和富集能力均不同。相关研究证明，蚯蚓对Pb的富集能力随着土壤中Pb浓度的增加而增强[27]。宋玉芳等[28]发现蚯蚓对Pb的耐受度较强。在杀螟丹与Pb等毒性比1∶1二元混合体系中，联合毒性以相加为主，在暴露72 h时减弱为拮抗作用。可能原因为，随着暴露时间的增加，杀螟丹逐渐损伤蚯蚓细胞膜[29]，抑制了蚯蚓机体对毒性物质的吸收，从而表现出联合毒性减弱的结果。

急性毒性实验只能通过研究蚯蚓存活率和死亡率等指标观察毒性效应，而不能进一步表征机体内各项生理生化指标的变化，有局限性。因此，研究蚯蚓经亚致死剂量杀螟丹和Pb单一和复合染毒后，其体内蛋白含量、SOD活性、CAT活性和MDA含量的变化趋势。综合分析生理生化指标变化发现，蚯蚓在机体遭受污染物胁迫时，首先蛋白含量会发生变化以警示受到污染损害，与此同时第一道抗氧化防御启动，机体内SOD活性等迅速被诱导，用于清除体内过多的氧自由基并产生H2O2，随后CAT活性增强并将H2O2转化为H2O和O2。SOD活性随染毒时间延长而降低，此时，MDA含量增强，表明机体受氧化损伤程度加重。因此，SOD活性和MDA含量均可作为蚯蚓应对氧化胁迫和机体受氧化损伤程度的判断指标。

蚯蚓主要通过肠道与土壤中的污染物接触，其表皮和中肠受到损伤进而危害其生长，蛋白含量在这种情况下极易发生变性[30]。杀螟丹、Pb单一作用以及二者联合作用下，随着暴露时间增加，不同浓度下蚯蚓体内蛋白含量变化在初期均表现为不稳定。这是由于污染物的刺激导致蚯蚓机体产生应激蛋白，如C-反应蛋白(CRF)、纤维连接蛋白(Fn)等，这引起蚯蚓体内蛋白总量的升高[31]。也有可能由于蚯蚓机体受到损伤，内环境紊乱造成体内蛋白含量的急剧增加。3种染毒模式均在中后期出现蛋白含量峰值，后又逐步降低，这与邰托娅等[32]的研究结果相似。可能因为后期染毒浓度较高且染毒时间较长时，经表皮的毒性和胃毒破坏了蛋白产生源，而机体代谢也需要蛋白提供能量，致使蛋白合成量减少。

染毒初期，杀螟丹单一作用主要胁迫蚯蚓胃部，经表皮细胞吸收后，蚯蚓机体作出抗氧化防御反应，SOD活性逐渐被诱导，因此，呈现先降低后升高趋势。后期由于时间增长导致机体胁迫程度加重，代谢受到影响而抑制SOD活性，当SOD被消耗后，机体不足以抵抗氧化反应，酶活性也随之降低，导致SOD下降甚至低于CK。Pb单一作用时，短时间内能够明显诱导蚯蚓体内SOD活性，染毒后期也呈现SOD受到抑制的现象，这与Shao等[33]的研究结论相似。杀螟丹与Pb二元联合作用时，初期联合毒性的相加作用促使SOD含量升高以抵抗氧自由基对机体的损害，后期联合毒性降低但对SOD活性抑制作用依旧增强，蚯蚓机体修复能力已无法承受伤害，氧化损伤严重，赵逸昳[34]在研究农药与重金属复合污染对蚯蚓SOD活性的影响时，得出了相似结果。值得注意的是，杀螟丹与Pb混合体系在后期对蚯蚓体内SOD活性胁迫作用均大于单一胁迫，说明复合污染对蚯蚓机体抗氧化性毒害大于单一污染。

CAT与SOD一起构成生物体防御体系，用于清除蚯蚓体内H2O2以免除机体氧化损伤。3种染毒模式下CAT活性整体变化均呈现先上升后下降并趋于稳定的趋势。杀螟丹单一作用时，染毒初期蚯蚓体内吸收杀螟丹较少，代偿性地诱导CAT活性升高，随时间延长CAT活性恢复至正常水平。后期蚯蚓机体对杀螟丹产生适应，CAT活性上升同时趋于稳定，这与已有研究结论相似[35]。Pb单一作用时，初期CAT活性变化同杀螟丹作用时相似，中后期CAT活性下降可能是由于SOD活性增强，产生的H2O2超过CAT转化能力，或蚯蚓机体受损严重，需要启动第二道抗氧化防御机制CAT酶来维持机体代谢平衡，这与Vitória等[36]观察到的生物体遭受胁迫时CAT活性变化的情况相同。杀螟丹与Pb二元联合染毒时，前中期变化均与杀螟丹和Pb单一染毒时相似，后期CAT活性有大幅回升甚至与初期活性相同，推测是因为后期联合毒性减弱，蚯蚓机体已启动CAT酶用于维持机体平衡，这与丁诗华等[37]提出的机理相似。

MDA含量可反映蚯蚓在受毒害时脂质过氧化水平，以评价蚯蚓细胞受损程度。杀螟丹和Pb分别单一作用时，MDA含量变化趋势相反。杀螟丹作用时，暴露时间内，MDA含量呈现先升高后降低的趋势，推测可能由于染毒初期蚯蚓受杀螟丹胁迫，抗氧化防御系统还未完全恢复功能，机体受氧化损伤导致脂质氧化产物MDA含量迅速升高。随着抗氧化防御系统的开启，各种抗氧化酶活性增强，消除了过多的氧自由基，机体逐渐适应胁迫环境，机体受氧化脂质损伤程度减轻，MDA含量降低。Pb作用时，MDA含量变化出现相反趋势，考虑是由于染毒初期蚯蚓受低浓度Pb胁迫，抗氧化防御系统中的SOD等足以清除氧自由基，机体氧化损伤较轻，随着Pb浓度的升高，SOD活性降低，机体氧化损伤严重。中期机体逐步适应Pb胁迫后，MDA含量达到平衡。后期染毒时间延长致使机体脂质氧化加重，导致MDA含量增加。Jager等[38]研究发现，蚯蚓体内MDA含量越高，则机体受到氧化损伤程度越大。这说明，长时间Pb胁迫对蚯蚓机体氧化损伤大于杀螟丹。杀螟丹与Pb二元联合作用下，MDA含量变化趋势与Pb胁迫时相似，但整体含量上升，考虑是由于联合毒性相比单一胁迫导致蚯蚓机体产生更多的自由基以致无法清除，自由基不断累积导致氧化应激而使MDA含量过高，该结果与段晓尘[39]和Narbonne等[40]的研究结果相似。与单一毒性不同，复合染毒中杀螟丹与Pb同时作用，杀螟丹破坏了细胞膜，影响了蚯蚓对体内Pb的降解代谢能力，Pb会逐渐积累至机体无法消除，MDA含量的升高也反映了这点。值得注意的是，与CK相比，二元混合体系下高浓度胁迫对蚯蚓体内MDA含量具有较强诱导作用，低浓度胁迫几乎无诱导作用，说明高浓度复合污染对蚯蚓机体氧化损伤较大。