不同pH值下锑(V)对大麦根伸长的毒性及其生物配体模型的构建

郭煊，王学东,*，李菊梅，马义兵

1. 首都师范大学资源环境与旅游学院，北京 100048 2. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081 3. 澳门科技大学澳门环境研究院，澳门 999078

中国的锑(Sb)储量大约3.0×106～3.5×106t，超过世界Sb储量的50%[1]。根据美国地质调查局国家矿产信息中心公布的数据，中国在2018年仍然是全球最大的Sb生产国，占全球Sb产量的70%以上[2]。

近几年间，由于采矿和冶炼、垃圾焚烧、煤炭和石油燃烧等人类活动日益频繁，越来越多的Sb元素进入到环境中[3]。Sb矿的开采对周边环境影响较为明显，在中国湖南省锡矿山矿区采矿和冶炼过程中产生了大量的固体废物，矿山北部沿废物堆和尾矿池的径流处观察到最高的Sb浓度达到39.16 mg·L-1[3]，与世界其他受污染地点报告的最高Sb浓度相似[4]。对安徽省3个煤矿采集的33个土壤样品分析发现超过75%的样品出现严重的Sb污染[5]。

Sb是一种对动植物均存在毒害作用的元素，可造成动物组织病变，植物生长不良、枯萎等毒性影响。林祥龙等[6]对跳虫进行的Sb毒性试验表明，设置的浓度范围内Sb(Ⅴ)不会直接造成其明显死亡，但会对跳虫生理行为和繁殖产生一定毒性影响。对小鼠实验研究发现，Sb2O3可引起肺组织炎性病变，肝脏小片坏死，急性实质性心肌炎病变等毒害作用[7]。植物Sb中毒的症状主要表现为生长缓慢、植株矮小、叶片瘦小及根系生长不良，严重时还会出现叶片发黄乃至植物枯萎[8-9]。较高的Sb浓度会显著抑制叶片和根系生物量的产生，并且Sb在植物中的积累会导致植物必需营养素浓度的变化[10]。

土壤环境中过量的Sb会通过食物链等途径进入人体。Sb对人体的急性毒性临床表现为结膜炎、视神经损伤、呕吐、腹泻和血尿等症状，慢性毒性主要表现为肺功能改变、慢性支气管炎等呼吸系统疾病以及心血管系统和肾脏病变，此外，Sb还具有潜在的致癌风险[11]。基于此，了解Sb在土壤环境中的迁移转化行为对于预防和控制土壤Sb污染具有重要意义。

许多研究表明，在土壤溶液中，Sb主要以Sb(Ⅴ)的形式存在。在广泛的氧化还原条件(360～140 mV)下，Sb仅以五价形式存在于土壤及土壤孔隙水中[12-13]，即使在厌氧条件下，土壤也可作为促进Sb(Ⅲ)氧化的催化剂[14]，可见土壤中以五价形态存在的Sb几乎占总Sb量的90%以上[1]。

环境中的pH值和氧化还原条件在很大程度上决定了金属元素的形态，Wilson等[15]绘制了不同系统下的pe-pH图，表明了pH值对Sb的形态变化具有重要影响。我国土壤种类复杂多样，土壤pH差异大，不同pH土壤Sb毒性可能会千差万别。pH值通过改变金属离子的化学形态或者与金属竞争生物配体结合位点进而影响金属离子的生物有效性和毒性，已有研究表明，pH从4.5到8.5，Cr(Ⅵ)和Ni毒性分别变化了4.73倍和7.28倍，随pH从4.5升高至8.0，Cu毒性变化了9倍[16-18]。因此，pH值被认为是影响金属离子在土壤中生物有效性的最重要因素[19]。

最近，生物配体模型(BLM)常被用于水体和土壤环境中量化pH及金属的一些伴随离子对金属毒性的影响[20]。目前，已有关于Cu、Ni、Zn、Cd和Cr等金属元素毒性预测BLM的报道[16-19, 21-22]，但关于Sb毒性的BLM还鲜见报道。基于此，本研究采用水培试验的方法，探索pH对Sb毒性的影响及其机制，并利用BLM理论建立其量化关系，从而为土壤中Sb风险评价提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

化学试剂：六羟基锑酸钾(KSb(OH)6)、CaCl2、NaOH、HCl、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, MES)和3-(N-吗啡啉)乙磺酸(3-(N-morpholino) propane sulfonic acid, MOPS)，均为分析纯，均购于北京百灵威科技有限公司。试验用塑料烧杯购于北京宏达科莱科技有限公司。大麦品种采用河南省农科院培育的驻大麦六号。

1.2 溶液配制

采取单因素控制的方法，设置9个pH组，分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。在每一个pH值梯度设置7个Sb(Ⅴ)浓度，分别为0、0.0951、0.1902、0.3804、0.7607、1.5215、和3.043 mmol·L-1，溶液pH值采用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl调节，采用1 mmol·L-1MES(pH<7.0)和3.6 mmol·L-1MOPS(pH≥7.0)作缓冲剂，以往研究证明MES和MOPS不与金属络合，不影响金属形态及其毒性[18, 23]。采用0.2 mmol·L-1CaCl2作为背景溶液。所有溶液都使用去离子水配制，每个处理均设置3个重复。溶液pH测定采用pH计(Delta320; Mettler, Zurich, Switzerland)。

1.3 大麦根伸长抑制试验

大麦根长试验采用ISO11269-1方法[24]，使用广口塑料烧杯作为培养容器，选择健康饱满的大麦种子，用去离子水冲洗干净，放置于底层铺有灭菌滤纸的玻璃培养皿上，并用去离子水没过种子，在20 ℃、无光照条件下放置36 h，待胚根长至2 mm后移至装有溶液的培养杯中，每杯6个。培养条件为白天光照14 h，温度为(24±2) ℃；夜间光照为10 h，温度为(18±2) ℃。光照强度为25 000 lx。大麦生长约5 d后测定根长，并计算不同Sb浓度处理下的大麦相对根伸长(RE)(%)。

(1)

式中：REt为不同Sb浓度处理下的根伸长；REc为对照根伸长。

1.4 Sb(Ⅴ)形态预测

Sb(Ⅴ)形态通过Visual MINTEQ 3.0计算(http://hem.bredband.net/b108693/)。输入的参数为pH以及Sb(Ⅴ)、K、Ca和Cl的离子浓度，设置CO2分压为35.46375 Pa。

1.5 数据统计和处理

剂量-效应曲线用log-logistic方程进行拟合[25]：

(2)

式中：y为相对于对照组的大麦根伸长(%)；x为Sb(Ⅴ)浓度；y0、a和b为拟合常数，a为log10(EC50)。利用拟合曲线求出不同评价指标的EC50值及其相应的95%置信区间。

1.6 生物配体模型的数学基础

c(TBL)=c(Sb(OH)6BL)+c(OHBL)+c(ClBL)+c(BL)

(3)

式中：c(TBL)为生物配体的络合容量(mol·L-1)；c(XBL)为与阴离子结合的生物配体活度(mol·L-1)；c(BL)为未被络合的自由配体活度(mol·L-1)。

(4)

式中：KXBL为条件结合常数，c(Xn-)为阴离子活度。

根据BLM的假设，当竞争离子OH-和Cl-被考虑的时候，整个生物配体结合位点被Sb(Ⅴ)所占据的比例为f，即分配系数，其大小与生物量以及总配体数无关，可以表达为公式(5)。

(5)

当达到50%抑制的时候，公式(5)可以转化为

(6)

(7)

式中：β为模型参数。将公式(5)中的f带入到公式(7)中，可得：

(8)

方程最优化检验采用最小残差平方和(RMSE)：

(9)

式中：N、n为处理的数据个数，Robserved大麦相对根伸长实测值(%)，Rpredicted为大麦相对根伸长预测值(%)。

2 结果与讨论(Results and disscusion)

2.1 不同pH条件下Sb(Ⅴ)的形态分布

图1 不同溶液pH下Sb(Ⅴ)的形态分布Fig. 1 The distribution of different Sb(Ⅴ) species as a function of pH

2.2 pH值对Sb(Ⅴ)毒性的影响

表1 不同pH条件下Sb(Ⅴ)对大麦根伸长的半数抑制效应浓度(EC50)值及95%置信区间Table 1 The measured Sb(Ⅴ) toxicity threshold at 50% inhibition (EC50) in the different pH sets for barely root elongation with 95% confidence intervals

图2 不同pH值下分别以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值变化曲线Fig. 2 The curve of EC50 as a function of pH expressed as (a) and EC50(Sb(OH)5) (b)

图3 大麦相对根伸长随和Sb(OH)5 (b)活度变化的剂量效应曲线Fig. 3 Dose-response curve of barley root elongation as a function of (a) and Sb(OH)5 (b) activity

图4 分别以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值与OH-活度的关系注：图中实线为线性拟合结果。Fig. 4 The relationship between EC50 value and OH- activity expressed as (a) and Sb(OH)5 (b)Note: The solid line in the figure is the linear fitting result.

(10)

式中：KSb(OH)5BL和KOHBL是形成Sb(OH)5与OH-配合物的稳定常数；将公式(10)代入公式(7)中，可得：

(11)

(12)

由上式可知离子浓度与根伸长RE之间的关系是非线性的，为了明确式中每个变量对RE的影响大小，分别对自变量进行灵敏性分析。控制其他变量不变，调整公式中某一变量，根据RE的变化量及斜率大小，可以判断每个自变量的灵敏度。灵敏度反映自变量对RE的贡献，较高的灵敏性表明该成分与大麦根配体位点有更强的亲和力。

本文通过溶液模拟试验探讨了不同pH值对大麦根伸长Sb(Ⅴ)毒性的影响，得出的主要结论如下：

图5 大麦相对根伸长(RE)分别与和Sb(OH)5 (c)的相关关系注：图中实线为线性拟合结果。Fig. 5 The relationships between barley root elongation (RE) and OH- (a), (b) and Sb(OH)5 (c)Note: The solid line is the linear fitting result.

图6 考虑和OH-活度后预测的大麦根伸长与实测大麦根伸长的相关关系Fig. 6 Correlation between predicted barley root elongation and measured barley root elongation after considering

(3)依据BLM方程，通过线性和非线性拟合获得BLM参数，建立了BLM，其预测值与实测数据具有良好的相关关系(r2=0.95，P<0.001)，表明Sb(Ⅴ)的BLM可以很好地预测Sb(Ⅴ)对大麦根伸长毒性。