稻米中铬的生物可给性及其对人体的健康风险评价

耿紫琪，王鹏飞，付雅祺，刘文菊，崔岩山,*

1. 中国科学院大学，北京 100049 2. 河北农业大学，保定 071000

铬(chromium, Cr)，是一种常见的重金属污染物。随着工业的发展，Cr以工业三废的形式存在于环境中的量越来越多。据统计数据显示，我国受到Cr污染的土壤已超过2 000万t[1]。随着土壤Cr污染日益严重，由作物通过食物链进入人体的Cr逐渐蓄积，并可能对人体产生致癌效应[2]。水稻作为我国主要的粮食作物之一，也是重金属Cr进入人体的重要途径[3]。王晓波等[4]调查发现广州市售大米中Cr的检出率为100%，超标率为26.67%；王国莉[5]分析了144份惠州本地大米样品中重金属含量，其中，Cr的超标率为34.03%，可见研究稻米中Cr的生物可给性并将其用于人体健康风险评估具有十分重要的意义。

目前，在污染物对人体的健康风险评估中，主要有2种方法：(1)动物实验(invivo)，用来评估生物有效性；(2)体外实验(invitro)，用来评估生物可给性(bioaccessibility, BA)。由于动物实验存在的周期长和个体间差异等问题[6]，使得invitro实验的方法受到越来越多的关注。目前，国内外对稻米中Cr的生物可给性的研究主要集中于模拟胃和小肠阶段[7-8]，但是由于结肠中存在着丰富的微生物，这些肠道微生物会影响食物中金属的代谢[9-10]，因此在食物消化过程中，进入结肠的食物残渣中的Cr同样不能被忽略。可见仅仅考虑胃和小肠阶段稻米中Cr的生物可给性，来评价人体健康风险是不够全面的。利用人体肠道微生物生态系统模拟物模型(simulator of human intestinal microbial ecosystem, SHIME)是在体外条件下模拟人体胃肠环境及微生物生态系统[11]。目前国内外有关于运用SHIME模型探究人体肠道微生物对土壤、食物中污染物代谢的报道[9-10,12]，但是对于稻米中Cr的研究报道较少。本研究采用生物可利用性提取模型(physiologically based extraction test, PBET)方法结合SHIME模型，探究稻米中的Cr在胃、小肠和结肠3个阶段的生物可给性，并分析稻米中Cr的生物可给性的影响因子，特别是肠道微生物对Cr的代谢作用。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 稻米样品

将从中国市场上收集了16个稻米样品，按照传统的稻米煮熟方式，以米/水1∶3(m∶m)的比例蒸煮30 min[9]，将煮熟的样品冷冻干燥后，研磨过60目筛，得到的米粉一部分经微波消解仪(Mars6，CEM公司，美国)消解。消解过程如下：取0.2 g米粉于50 mL消解管中，加入5 mL浓硝酸(优级纯)、3 mL过氧化氢(优级纯)静置过夜，次日设置消解温度为80 ℃，缓慢加热，持续30 min，升温至120 ℃，保持1 h，消解完毕。转移至赶酸器中于160 ℃赶酸至1～2 mL左右，冷却至室温后，用超纯水定容至25 mL，过0.45 μm滤膜后，用电感耦合等离子体质谱仪(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS)(Agilent 7500a，Thermo Fisher Scientific公司，美国)测定稻米中Cr的总量。另一部分米粉可用于invitro实验研究。

1.2 in vitro实验

本研究结合Ruby等[13]提出的PBET方法和SHIME模型[12]，实验包括3个连续的阶段，即胃阶段、小肠阶段和结肠阶段。实验具体操作步骤如下。

1.2.1 胃阶段

配制模拟胃液(内含柠檬酸、苹果酸、乳酸、冰乙酸和氯化钠)，用浓盐酸调pH至1.5，加入胃蛋白酶。取3 g稻米粉于50 mL离心管中，加入30 mL模拟胃液摇匀后再次测pH，用盐酸调节pH在1.5左右。置于37 ℃、150 r·min-1的恒温震荡培养箱中振荡1 h，在1 h后，吸取5 mL反应液，过0.45 μm滤膜，4 ℃保存待测。

1.2.2 小肠阶段

胃阶段结束后在消化液中加入NaHCO3粉末，将消化液pH调至7.0左右，加入胰酶、胆盐，测定pH并保证其在7.0±0.1。置于37 ℃、150 r·min-1的恒温震荡培养箱中振荡4 h，4 h后取出，吸取5 mL反应液，过0.45μm滤膜，4 ℃保存待测。

1.2.3 结肠阶段

小肠阶段结束后，将小肠消化液倒入100 mL厌氧血清瓶中，吸取SHIME模型降结肠中的反应液30 mL加入厌氧血清瓶，并迅速通入15～20 min氮气保证厌氧环境。置于37 ℃、150 r·min-1的恒温震荡培养箱中，48 h后取出，吸取5 mL反应液，过0.45 μm滤膜，4 ℃保存待测。

胃、小肠和结肠阶段消化液中的Cr含量采用ICP-MS进行测定，每个样品在每个消化阶段都做3个平行。实验中所涉及到的试剂纯度及厂商如表1所示。

1.3 计算方法

1.3.1 生物可给性

稻米中Cr在模拟胃、小肠和结肠3个阶段的生物可给性可由式(1)计算。

BA=cV/cSMS×100%

(1)

式中：BA为稻米中Cr的生物可给性(%)；c为invitro实验的胃、小肠或结肠阶段反应液中Cr的可溶态含量(mg·L-1)；V为各反应器中反应液的体积(L)；cS为稻米样品中Cr的含量(mg·kg-1)；MS为加入反应器中稻米样品的质量(kg)[14]。

1.3.2 稻米中Cr的健康风险评估

稻米中的Cr每日暴露量(average daily dose, ADD)由式(2)计算。

ADD=cm×Wc×BA/Wb

(2)

式中：cm为稻米样品中Cr的浓度(mg·kg-1)；Wc是每人每天消耗的稻米总量(kg·d-1)；BA是小肠阶段Cr的生物可给性；Wb为成年人或儿童的平均体重(kg)。成年男子的体重为66.2 kg[15]，6岁男童的体重为23 kg[16]，成人每天稻米摄入量为389 g·d-1[17]，儿童为277 g·d-1[18]。稻米中Cr的健康风险指数危害商(hazard quotient, HQ)的计算方法由式(3)计算。

HQ=ADD/RfD

(3)

式中：Cr的参考剂量RfD为1.5 mg·kg-1·d-1[7]，如果HQ>1.0，就说明该稻米样品存在健康风险。由于人体主要的吸收器官是小肠，因而用小肠部分Cr生物可给性的结果来计算人体健康风险。

1.4 数据分析

采用SPSS 24 (IBM)和Excel 2010软件分析数据。

2 结果(Results)

2.1 稻米中Cr的含量

从市场上收集到的稻米样品中Cr的含量如表2所示，其含量范围为0.092～0.561 mg·kg-1，平均值为0.232 mg·kg-1，尚未超过国家食品卫生标准(GB2762—2017)中规定的Cr的限量标准(1.0 mg·kg-1)[19]。

2.2 稻米中Cr溶解态及其在胃、小肠和结肠3个阶段的生物可给性

稻米中Cr的溶解态含量及其生物可给性在3个阶段中大体呈现逐渐升高的趋势(表2和图1)。模拟胃阶段Cr的溶解态含量范围为0.043～0.340 mg·kg-1，平均值为0.126 mg·kg-1，Cr的生物可给性范围为34.3%～66.1%，平均值为52.5%；模拟小肠阶段Cr的溶解态含量为0.052～0.455 mg·kg-1，平均值为0.179 mg·kg-1，Cr的生物可给性范围为46.4%～89.1%，平均值为75.1%；模拟结肠阶段Cr的溶解态含量范围为0.067～0.481 mg·kg-1，平均值为0.195 mg·kg-1，Cr生物可给性范围为64.4%～94.5%，平均值为83.0%。由胃阶段至小肠阶段，Cr的生物可给性上升了1.4倍，由小肠阶段至结肠阶段，Cr的生物可给性上升了1.1倍。

表1 实验试剂及其厂商Table 1 Experimental reagents and their manufactures

图1 16种稻米样品中Cr在胃、小肠和结肠阶段的生物可给性注：不同字母表示同一稻米样品中Cr在胃、小肠和结肠阶段生物可给性差异显著(P<0.05)；图中数据为样本均值±标准偏差。Fig. 1 Bioaccessibility of Cr in stomach, small intestine and colon of 16 rice samplesNote: The different letters means the significant differences of bioaccessibility of Cr in the gastric, small intestinal and colon phases for the rice samples (P<0.05); the data were expressed as sample mean±standard deviation.

表2 稻米中Cr的总量以及各阶段溶解态含量Table 2 The total concentration of Cr in rice and the dissolved concentration in each phase

2.3 人体的健康风险评估

在考虑小肠阶段Cr的生物可给性和不考虑小肠阶段Cr生物可给性2种情况下，按公式计算分析得到成人和儿童通过稻米途径摄入Cr的每日暴露量(ADD)以及健康风险指数危害商(HQ)(表3)。当考虑Cr在小肠阶段的生物可给性时，成人ADD范围为3.04×10-4～2.67×10-3mg·kg-1·d-1，平均值为1.05×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范围为2.03×10-4～1.78×10-3，平均值为7.00×10-4；儿童ADD范围为6.23×10-4～5.48×10-3mg·kg-1·d-1，平均值为2.15×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范围为4.15×10-4～3.65×10-3，平均值为1.44×10-3；不考虑生物可给性，成人ADD范围5.40×10-4～3.30×10-3mg·kg-1·d-1，平均值为1.37×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范围为3.60×10-4～2.20×10-3，平均值为9.10×10-4；儿童ADD范围为8.49×10-4～6.48×10-3mg·kg-1·d-1，平均值为2.22×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范围为5.66×10-4～4.32×10-3，平均值为1.48×10-3。可见成人和儿童的HQ均<1.0，说明稻米样品中的Cr对人体的健康风险较小。

3 讨论(Discussion)

3.1 胃肠阶段稻米中Cr的生物可给性

表3 稻米中Cr的健康风险评估Table 3 Health risk assessment of Cr in rice

3.2 结肠阶段稻米中Cr的生物可给性

结肠阶段，稻米中Cr的生物可给性为64.4%～94.5%，显著高于小肠阶段，是小肠阶段的1.1倍，这一结果说明肠道微生物可促进稻米残渣中Cr的溶出释放。本实验结果与前人的研究结果具有相同的规律。尹乃毅等的[12]研究表明，肠道微生物可促使土壤中Cr的溶出，使得结肠阶段Cr的生物可给性高于小肠阶段。Wang等[10]探究了结肠中微生物对蔬菜中Cr的生物可给性的影响，发现肠道微生物的作用增加了蔬菜中Cr的溶出。由于结肠中存在着丰富的微生物，且其代谢能力很强，未被消化吸收的稻米残渣进入结肠阶段后，其中的蛋白质和纤维可作为碳源和能源供肠道微生物利用[24]。微生物在代谢稻米残渣中的有机质时，就有可能会将稻米残渣上吸附的Cr释放出来进入溶液，使液相中Cr的含量增加，生物可给性增加。

3.3 稻米摄入导致Cr的人体健康风险

稻米作为我国主要的粮食作物之一，对其重金属的健康风险研究至关重要，也被学者广泛关注。有研究表明，食物是人体摄入Cr的主要来源，其贡献率最高可达98%[25]，因而，当Cr由稻米途径进入人体，并在人体内蓄积过量后所造成的严重后果不容忽视[2]，研究Cr对人体的健康风险十分必要。Li等[7]将生物可给性的结果用于来自江苏宜丰和太仓等5个地方的70种稻米样品中Cr对人体的健康风险评估中，发现成人和儿童的HQ均远<1.0。Praveena和Omar[8]计算了从马来西亚市场收集的22种稻米样品中Cr的生物可给性，并对稻米中Cr的健康风险进行评估，成人的HQ为8×10-4，儿童的HQ为5×10-3，二者均<1.0，表明稻米样品中Cr对人体的健康影响较小。Omar等[26]评估了马来西亚雪兰莪州稻米中Cr的健康风险，发现所收集的22种稻米样品中的Cr不存在对人体的潜在健康风险。在本研究中，对于从中国市场收集的16种稻米样品，利用invitro实验方法评估了稻米样品中Cr对人体的健康风险。针对成人和儿童，在考虑和不考虑生物可给性2种情况下，成人和儿童的HQ均<1.0，表明这16种稻米的摄入不会引起人体健康风险，与前人的研究结果一致。