微囊藻毒素诱导细胞自噬的研究进展

何丽，刘林，林长高，隗黎丽

江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045

随着工农业的迅速发展，由水体富营养化引起的蓝藻水华不仅会恶化水质，更为严重的是，蓝藻细胞死亡后所释放的藻毒素可富集于水生生物体内，随后通过食物链的传递危害人类健康[1]。在众多藻毒素中，微囊藻毒素(microcystins, MCs)为毒性最强、分布范围最广的毒素之一，其主要由微囊藻属(Microcystis)、鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)、束丝藻属(Aphanizomenon)以及颤藻属(Oscillatoria)等蓝藻产生[2-3]。MCs进入机体内依靠多种有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides, OATPs)的转运，研究显示，OATPs在肝脏、肾脏、性腺和脑等组织中均存在表达[4]。因此，MCs能进入肝脏、肾脏、性腺及脑组织中而发挥其肝毒性[5]、肾毒性[6]、生殖毒性[7]及神经毒性[8]作用。

自噬在所有真核生物的进化上高度保守，是细胞内一种重要的溶酶体依赖性降解机制[9]。根据内容物质运输到溶酶体途径的不同，细胞自噬可以分为微自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperone mediated autophagy, CMA)和巨自噬(macroautophagy)[10]。微自噬是溶酶体膜直接内陷吞噬胞质成分，而分子伴侣介导的自噬是在分子伴侣(HSC70)的作用下溶酶体降解含有KFERQ序列的可溶性胞质蛋白底物[11]。巨自噬即通常所说的自噬，是指具有双层膜结构的自噬体(autophosome)包裹着胞浆成分与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autopholysome)，最终胞浆成分被溶酶体酶降解的过程。基础水平的自噬能清除细胞内衰老细胞器及长寿蛋白以维持细胞稳态[12]。然而，过低或过高水平的细胞自噬都会导致细胞不可逆死亡即Ⅱ型程序性细胞死亡(programmed cell death Ⅱ, PCDⅡ)[13]。本文就MCs诱导细胞自噬的相关研究进行综述，并总结其可能存在的诱导机制，以期为进一步明确自噬在MCs的细胞毒性中发挥的作用提供理论基础。

1 微囊藻毒素及其毒性机制(Microcystins and their mechanisms of toxicity)

MCs是一类相对分子质量在800～1 100 Da之间的单环七肽化合物，其主要由非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases, NRPSs)、聚酮合成酶(polyketide synthases, PKSs)和其他杂合酶等多功能蛋白复合体合成[14]。该化合物的结构通式为环(D-Ala1-L-X2-D-isoMeAsp3-L-Z4-Adda5-D-isoGlu6-Mdha7)，其中，2、4号位的X、Z为2种可变的L型氨基酸[15-16]。在已鉴别的100多种MCs异构体中，MC-LR、MC-RR和MC-YR为分布广泛且毒性较强的3种异构体，其中L、R和Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸[17]。MCs理化性质稳定，耐酸碱、紫外线辐射及高温，常规处理方法(如混凝、沉淀、絮凝和过滤等)很难有效去除水体中的MCs[18]。因此，MCs对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题。

2 微囊藻毒素诱导细胞自噬的研究(Studies on autophagy induced by microcystins)

现有报道主要以肝细胞、肾细胞、性腺细胞和神经细胞为研究对象，开展了MCs诱导细胞自噬的研究。下面将主要从MCs对不同细胞自噬的影响以及机制进行综述。

2.1 微囊藻毒素诱导细胞自噬

2.1.1 微囊藻毒素诱导肝细胞自噬

肝脏是MCs作用的靶器官，主要是由于肝脏中存在多种高表达的OATPs，如OATPl Bl、OATPl B3和OATPl A2等，MCs在这些OATPs的主动转运作用下进入肝细胞，造成严重的肝损伤[27]。大量报道表明，MCs可导致哺乳类[28-29]、鱼类[30-31]和两栖类[32]等动物肝脏超微结构和多种酶活性的改变，并诱导肝细胞凋亡或坏死，从而导致机体肝功能障碍。近年来，研究者发现MCs在造成肝细胞损伤的同时启动了细胞自噬。如Dabholkar和Carmichael[33]发现MC-LR除了可诱导小鼠肝细胞内质网和线粒体肿大、空泡化及脂滴的形成之外，还诱导了含颗粒状物质或碎片的自噬泡的产生，推测MC-LR诱导了肝细胞自噬。Menezes等[34]将人肝癌(HepG2)细胞暴露于MC-LR(6、12和25 mg·L-1)24 h后，利用透射电镜可观察到MC-LR诱导HepG2细胞自噬体的产生，但数量随着浓度的增加而减少，而高浓度MC-LR诱导的细胞凋亡及坏死显著增加。吴珍等[35]在饮用水中添加MC-LR对小鼠染毒3个月，发现MC-LR诱导的小鼠肝脏自噬相关基因LC3α转录水平的增加与线粒体膜电位的下降存在相关性，认为在线粒体膜电位消失的同时，细胞启动了自我保护机制。由以上报道可知，MCs可诱导肝细胞自噬的发生。

2.1.2 微囊藻毒素诱导肾细胞自噬

研究表明，肾脏中也存在多种OATPs，致使MCs容易造成肾脏损伤[36]。非洲绿猴肾(Vero-E6)细胞经5、20和40 mg·L-1MC-LR(LMECYA113提取物)胁迫24、48和72 h后，MC-LR对Vero-E6细胞溶酶体、内质网、线粒体和细胞骨架的损伤具有时间-剂量依赖性，低浓度的MC-LR能诱导Vero-E6细胞内质网和线粒体自噬，而较高浓度则会导致Vero-E6细胞凋亡及坏死[37]。Menezes等[34]将Vero-E6细胞分别经6、12、25和50 mg·L-1MC-LR (LMECYA110提取物)暴露24 h，发现低浓度MC-LR诱导Vero-E6细胞自噬，而高浓度主要导致Vero-E6细胞坏死。综上所述，MC-LR能诱导肾细胞自噬且自噬水平与MC-LR的浓度有关。

2.1.3 微囊藻毒素诱导性腺细胞自噬

MC-LR可作为一种内分泌干扰物造成机体生殖系统功能紊乱而影响动物机体的繁殖、生长和发育[38]，而细胞自噬与MC-LR的生殖毒性密切相关。Adegoke等[39]报道MC-LR可引起牛睾丸支持(Sertoli)细胞线粒体损伤并诱导线粒体自噬。Chen等[26]利用不同浓度MC-LR对大鼠Sertoli细胞染毒后，发现低浓度MC-LR能诱导细胞自噬，而高浓度MC-LR可通过影响溶酶体的功能而导致自噬体堆积，随后下调Bcl-2蛋白表达水平促进Sertoli细胞凋亡。另有学者发现，MC-LR可显著抑制中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞增殖，并诱导CHO细胞自噬[40]。在Liu等[41]的研究中，不同浓度(8.5、17和34 mg·L-1)MC-LR可促进小鼠卵巢颗粒(KK-1)细胞内ATG5、ATG12、Beclin1及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的蛋白表达而诱导细胞自噬。

2.1.4 微囊藻毒素诱导神经细胞自噬

MC-LR具有神经毒性，可通过血脑屏障进入脑组织[8]。慢性MC-LR暴露可引起小鼠神经细胞凋亡、记忆丧失和学习障碍，从而引起阿尔茨海默病样症状[42]。研究显示，自噬在神经系统疾病中具有重要的调控作用，而MC-LR诱导神经细胞自噬的研究也有相应报道。为确定MC-LR诱导的自噬是否为神经毒性的潜在机制，Yang等[43]利用人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞经15 mg·L-1和30 mg·L-1MC-LR处理48 h后，发现MC-LR可显著抑制SK-N-SH细胞活性，自噬相关蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和p62表达的升高均呈浓度依赖性，此外，与对照组相比，MC-LR处理组细胞内游离Ca2+浓度显著升高，认为由MC-LR引起的细胞存活率降低可能与自噬通量的抑制和细胞内游离Ca2+浓度的增加有关。对神经细胞株PC12细胞进行MC-LR(1、25和50 mg·L-1)染毒24 h后，发现MC-LR处理组细胞内ROS水平显著升高，线粒体膜电位显著降低，线粒体自噬相关基因PINK1和Parkin表达呈剂量依赖性上升，推测MC-LR通过氧化应激激活PINK1/Parkin线粒体自噬，参与MC-LR致PC12细胞损伤[44]。然而，MC-LR引发的自噬在神经系统中的作用机制还有待深入研究。

2.2 微囊藻毒素诱导细胞自噬的机制

细胞自噬发生过程由多种蛋白参与，首先机体受到刺激后在ULK1-ATG13-ATG101和Beclin1-Vps34蛋白复合物的作用下自噬体成核延伸，随后在ATG12-ATG5-ATG16L1和ATG8(LC3)-PE这2个泛素结合系统的参与下形成自噬体，最终通过相关蛋白识别机制与溶酶体融合形成自噬溶酶体进行底物降解[45]。该过程受多条上游信号通路的调控，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通过AMPK-mTORC1、PI3K/AKT/mTORC1和Ras/ERK/RSK/mTORC1等信号通路调控自噬相关蛋白ULK1复合物，从而进一步调节自噬水平[46]。Beclin1(酵母Atg6同源物)信号通路在自噬调节中发挥重要作用，Beclin1蛋白中BH3(Bcl-2-homology3)、中央螺旋区(CCD)和进化保守区(ECD)3个结构域可与其他因子如Bcl-2/XL、DAPK、Mst1、JNK1和ClassⅢ PI3K等相互作用，影响细胞自噬[47]。而P53作为一个主要的抑癌基因，可通过调控AMPK和Akt/mTOR通路及ATG12的表达来调节自噬[48]。此外，细胞应激通路也参与细胞自噬的调控[49]。其中，细胞应激通路主要包括线粒体氧化应激和内质网应激2条途径。目前，认为MCs对细胞自噬效应的诱导主要通过诱发细胞应激而实现，即与线粒体氧化应激和内质网应激途径有关。

2.2.1 线粒体氧化应激途径

2.2.2 内质网应激途径

内质网(endoplasmic reticulum, ER)参与细胞内如蛋白质合成与修饰、多肽链折叠、钙代谢和脂代谢等多种生物学功能[57-58]。当机体受到刺激(有毒物质等)时，因内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERs)产生过多的未折叠或错误折叠的蛋白致使机体启动未折叠蛋白反应(unfold protein reaction, UPR)[59]。UPR主要由存在于内质网膜上的3个跨膜分子PERK(pancreatic ER kinase-PKR-like kinase)、ATF6(activating transcription factor 6)、IRE1(inositol-requiring enzyme 1)参与调控。目前，越来越多的研究表明PERK、ATF6和IRE1与自噬的发生密不可分[60]。证据表明，PERK-eIF2α-ATF4途径及PERK-AMPK-mTORC途径参与ERs介导的细胞自噬[61-62]。其中，PERK-eIF2α-ATF4途径可激活一系列自噬相关基因(autophagy related genes, ATGs)包括LC3B、ATG3、ATG7、ATG10、ATG12、ATG16L1和Beclin1等的表达而促进自噬[63]。此外，IRE1-JNK/XBP1-Beclin1途径诱导的自噬也得到了验证[64]。而ERs可导致机体内Ca2+平衡紊乱，诱导Ca2+从内质网释放到细胞质中，从而激活mTOR和AMPK等自噬上游信号通路[65]。为探讨ERs与自噬之间的关系，Zhang等[40]分别应用MC-LR联合ERs抑制剂4-PBA或自噬抑制剂3-MA共同处理CHO细胞24 h，结果显示，抑制ERs后，自噬标志性蛋白Beclin1 和LC3 Ⅱ表达降低，LC3 Ⅰ表达升高，而细胞凋亡率明显下降；抑制自噬后，ERs标志蛋白如GRP78、ATF6、PERK、IRE1和CHOP表达升高而细胞凋亡率显著增加。由此可知，ERs是MC-LR诱导自噬的重要因素之一，ERs促进细胞凋亡，而自噬作为保护机制能抑制细胞凋亡的发生。Liu等[41]的研究结果表明，MC-LR能够通过上调ERs相关蛋白eIF2α、CHOP、XBP-1、GRP78及PERK和自噬相关蛋白ATG16、ATG12、ATG5、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ及Beclin1的表达，诱导KK-1细胞ERs和自噬，推测MC-LR诱发的ERs可通过PERK/eIF2α/ATG12和XBP-1/Beclin1信号通路诱导细胞自噬，而细胞经NAC预处理后，MC-LR通过下调上述蛋白的表达抑制ERs和自噬，这表明氧化应激介导了MC-LR诱导的ERs，随后通过ERs相关途径调控自噬。然而ERs在MCs诱导细胞自噬的具体信号调控机制有待今后进一步研究。

3 结论及展望(Conclusions and prospects)

目前，水质恶化日趋严重，广泛存在于水体中的MCs备受人们关注，因此，深入研究MCs的毒性机理及自噬在机体受MCs胁迫时发挥的具体作用具有重要意义。研究表明，MCs能够通过线粒体氧化应激和内质网应激2种途径诱导细胞自噬，细胞自噬可能是机体应对MCs毒性的早期反应，通过自噬清除受损细胞器以提高细胞的生存，而随着暴露时间延长及暴露浓度的上升，细胞凋亡及坏死被诱导。

目前针对MCs诱导细胞自噬的研究已逐渐开展，但还存在很多不足，今后可从以下几个方面进行深入研究。(1)现阶段的研究主要集中于高等哺乳动物，而要真正全面地揭示调控MCs诱导细胞自噬的机制，还需对长期暴露于MCs中的低等水生生物如鱼类等进行更深入细致的研究。(2)现有研究表明，MC-LR的转运和代谢途径基因的多态性可以影响毒素的转运和代谢，导致MC-LR暴露机体敏感性存在差异，从而致使MC-LR进入细胞内发挥的毒性作用存在差异[5,66]，这可能是目前MC-LR诱导细胞自噬的研究主要集中在肝细胞、肾细胞、生殖细胞和神经细胞等上，而还未在其他组织细胞深入开展的原因之一。因此，后续可以从MC-LR是否诱导其他不同组织细胞自噬以及诱导机制是否存在差异等方面进行探索，以期全面剖析MC-LR的毒性机理。(3)MCs种类繁多，已鉴定的100多种异构体之间存在差异，而目前的研究主要针对MC-LR对动物机体的影响，而其他种类MCs的毒性作用机理的异同尚未可知。(4)自噬的调控机制错综复杂，而现有MCs诱导细胞自噬机制的研究主要针对自噬体形成过程，其上游调控信号通路及自噬溶酶体的降解途径未见详细报道，对自噬流的研究尚不系统，且自噬在机体受MCs胁迫时具体发挥的作用以及途径还需进一步研究。