Hg2+对中国鲎幼体急性毒性及MT的诱导效应

鲍虞园，叶国玲，钟金香，陈海刚，李银康，关杰耀，颉晓勇,*

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300 2. 上海海洋大学水产与生命学院，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，水产科学国家级实验教学示范中心，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306 3. 广东省土地调查规划院，广州 510075 4. 北部湾大学海洋学院，钦州 535011

汞(Hg)是一种广泛而持久存在的有毒重金属污染物，是人和其他动物的非必需元素[1-2]。汞被联合国环境规划署列为全球性污染物，是除了温室气体外唯一一种对全球范围产生影响的化学物质，具有跨国污染的属性，已成为全球广泛关注的环境污染物之一[3]。自然水体中的汞主要源于大气沉降和未经处理的工业废水(冶金、化工和颜料等)、生活污水、含汞农药、化肥及粪便等[4-5]。雷富等[6]对北部湾近岸海域海水中重金属污染的调查中发现，汞含量变化范围为0.013～0.237 μg·L-1，平均值为0.043 μg·L-1，超标率为19.6%，存在潜在生态风险。水环境中的汞不能被生物降解[7]，会通过抑制水生动物抗氧化酶活性来影响其防御系统[8]，引起机体损伤[9]，短暂暴露于高浓度汞会导致水生动物产生应激反应、免疫力降低和代谢紊乱，并妨碍其生长和发育[10-11]。低浓度汞也具有很大毒性，水生动物通过呼吸和摄食等行为富集水体汞[12]，转化为毒性更大的有机态，通过食物链危害人畜。20世纪50年代，日本水俣市周围海域被工厂废液中甲基汞大量污染，食用鱼、虾和蟹等水产品的人们出现水俣病[13]。这证明了汞被水生生物吸收后不仅危害这些生物自身的生长繁殖，而且可以通过食物链进入人体，进一步危害到人类的健康和生存。

金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一类普遍存在于生物体内的低分子量(6～7 kDa)、富含半胱氨酸、热稳定性和可诱导型非酶蛋白[14]。MT的主要特点是在转录水平上易被环境中的重金属所诱导，而且这种诱导与重金属浓度具有相关性，可以反映环境中的重金属含量水平[15]。Fang等[16]的研究表明，汞暴露显著改变了四角蛤蜊消化腺外套膜和鳃中的MT mRNA的转录，MT含量随Hg2+剂量上升而上升。因此，通过监测生物体内MT含量变化，可预测生物体受重金属暴露的状况和重金属的污染压力[17]。MT可作为重金属污染物、潜在重金属污染暴露和毒性效应早期预警的主要生物标志物，以及作为环境中重金属污染胁迫与风险评价以及监测的分子生态毒理学诊断指标。这对制定预防性的管理措施和及时监控环境污染具有重要的指导意义。

中国鲎(Tachypleustridentatus)是具有极高经济价值、药用价值和科研价值的古老“活化石”[18]，现主要分布在我国北部湾海域。近30年来，因为人工大肆捕杀造成了中国鲎数量急剧降低，而环境污染也使其繁殖生态环境遭到严重破坏，该物种濒临灭绝。2019年3月，世界自然保护联盟(IUCN)正式将中国鲎在IUCN红色名录中的等级从原本的数据缺乏更新为濒危。目前该物种的生态毒理学研究匮乏，本研究采用静水生物测试法研究了汞对中国鲎幼苗的急性毒性，同时测定了急性暴露96 h后幼鲎体内MT含量的变化，目的在于了解Hg2+对中国鲎幼苗的安全浓度并初步探讨MT的解毒效应和作为重金属污染生物标志物的可行性，针对自然水体对幼鲎的安全性进行风险评价，同时为渔业部门制订水质标准提供理论参考依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

中国鲎幼苗：于2018年5—10月在中国水产科学研究院南海水产研究所湛江中国鲎研究基地人工繁育所得。选择反应灵敏、大小一致的中国鲎幼体在室内水族箱中驯养7 d用于试验，经测定，供试幼鲎个体鲜质量为(0.028±0.002) g，头胸甲宽(0.581±0.026) cm。

实验用水为经过滤消毒的自然海水，盐度为27～30，pH为7.6～7.8，溶氧不低于4 mg·L-1，水质符合《渔业水质标准》(GB11607—89)[19]。实验所用HgCl2为分析纯(国药集团上海有限公司)；预先用去离子水配制为1 g·L-1的母液，于4 ℃保存，实验时用海水进行稀释。

1.2 实验设计与样品采集

实验在光照培养箱中进行，温度为26 ℃，昼夜时间比14 h∶10 h，采取静水生物测试法，实验期间不更换实验液，为确定实验用液质量浓度的大致范围，先进行预实验。预实验的HgCl2质量浓度设定5个梯度,分别为0.005、0.05、0.5、5和50 mg·L-1。根据预实验结果24 h绝对致死浓度(24 h-LC100)及96 h最大非致死浓度(96 h-LC0)确定正式实验浓度范围，按等对数间距设立6个实验组(0.500、0.997、2.000、3.990、7.962和16.00 mg·L-1)及1个对照组，每组3个平行。每个平行组放入10只幼鲎。试验过程中，前8 h连续观察幼鲎的行为状况和中毒症状，记录个体的死亡时间及死亡数，及时捞出死亡个体。死亡的判断标准为用玻璃棒连续触碰剌激个体无任何反应即视为死亡。

根据《渔业水质标准》(GB11607—89)[19]中汞浓度≤0.0005 mg·L-1，同时结合急性毒性实验的96 h半数致死浓度(96 h-LC50)设置实验组质量浓度为0.005、0.025和0.250 mg·L-1和对照组，每组3个平行，每个平行放置60尾中国鲎幼苗，整个试验持续96 h，试验期间不投喂。在试验进行0、24、48、72和96 h时从每个烧杯中取幼鲎活体10尾，放入清洁海水中，洗去表面的污垢和重金属，放入离心管，置于-80 ℃超低温冰箱中，以备测定MT。

1.3 MT含量测定

将冻存的样品于低温下解冻，用预冷的生理盐水冲净，再用滤纸吸去表面水分，称取适量的样品，按m∶m=1∶10加入4 ℃预冷的生理盐水，在冰浴条件下，用超声波进行匀浆。匀浆液用冷冻离心机在4 000 r·min-1下离心10 min，取上清液置于4 ℃下保存，24 h内测定完毕。

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定MT含量[20]。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，操作按试剂盒说明进行。试剂盒在室温放置30 min后打开，首先用标准品稀释液稀释标准品，测定吸光值，绘制MT标准曲线；然后向酶标板依次加入待测样品、生物素标记的抗-MT抗体、链霉亲和素-HRP；酶标板经洗板机洗板后，加显色剂，振荡混匀后，避光显色10 min；加终止剂50 μL终止反应；10 min内用Biorad xMark酶标仪在450 nm波长测定吸光值，根据标准曲线计算MT含量。

1.4 数据处理

用SPSS 22.0对所得数据进行分析统计，利用概率单位法计算出24、48、72和96 h的LC50，求出死亡率概率单位与实验液质量浓度对数的回归方程[21]；安全质量浓度(mg·L-1)按下式计算[22]：

目前，钾肥市场总体供应量减少，但钾肥需求支撑较弱，新单采购意愿不强。复合肥企业正处于秋季备肥生产周期，将对钾肥市场起到需求支撑作用；全球钾肥市场供给偏紧，贸易商探涨可能仍存。预计短期内国内氯化钾价格将高位持稳，重点关注国内钾肥大合同谈判情况。

采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比较法对不同浓度组间的MT含量数据进行差异显著性检验(P<0.05为差异显著)。

2 实验结果(Results)

2.1 中国鲎幼体的中毒症状

实验开始后，不同质量浓度实验组的中毒现象存在明显差异，具体表现为浓度为0.500 mg·L-1和0.997 mg·L-1的HgCl2溶液对实验个体的毒性作用不明显，与对照组基本相同，受试个体在入液后没有表现明显的不适反应，于容器中仰泳3～5 min后静置于试验容器底部，少数缓慢游动或爬行；而16.000 mg·L-1浓度组中实验个体的中毒症状明显，受试个体入液后显得十分不安，在烧杯内上下游动，时有与杯壁碰撞现象，经过约40 min适应才趋于安静、沉于底部。浓度为0.500 mg·L-1和0.997 mg·L-1实验组幼鲎24 h内无明显异常和死亡，24 h后个别幼鲎活动缓慢，甚至不活动，逐渐出现个体死亡。其他浓度组实验个体随着时间延长，在容器内的活动能力明显减弱，伏于底部，活动频率显著降低。实验开始后8 h，16.000 mg·L-1浓度组个体仅附肢尚可颤动，对外界刺激(用玻璃棒刺激)反应也变得较为迟钝，约10 h，16.000 mg·L-1浓度组首先出现死亡现象。浓度为2.000、3.990和7.962 mg·L-1的实验组经过3～5 h后才陆续出现死亡。死亡个体腹部微微翘起，附肢逐渐松弛呈伸展状，鳃书呈打开的书本状。

2.2 Hg2+对中国鲎幼体的急性毒性

急性毒性实验结果显示，不同浓度重金属溶液对幼鲎造成不同程度伤害，随Hg2+浓度的增加，幼鲎死亡率呈逐渐上升趋势，直至全部死亡。对各试验组中受试幼鲎死亡情况进行统计，计算死亡率。根据表1结果计算得知，不同暴露时间下幼鲎累计死亡率(y)与Hg2+质量浓度对数(x)的关系均为直线回归，两者之间具有较好相关性；进一步计算可得24、48、72和96 h-LC50以及安全质量浓度(SC)，结果如表2所示。结合表1和表2结果可知，Hg2+质量浓度≤2.000 mg·L-1的实验组96 h的累积死亡率均<50%，最高剂量组(16.000 mg·L-1)96 h的累积死亡率接近100%。Hg2+质量浓度≤0.997 mg·L-1时，24 h内幼鲎反应与对照组无明显差异，未见死亡；随着Hg2+浓度增大或实验时间延长各实验组均出现死亡，且死亡率逐步上升，其24 h-LC50为15.013 mg·L-1。同一Hg2+质量浓度组的幼鲎，随着时间延长毒性效应逐渐增强，死亡率明显上升。而相同时间内不同Hg2+质量浓度组的幼鲎，随着质量浓度增大，毒性效应增强，死亡率上升，其48 h-LC50为7.084 mg·L-1。由表2可知，半致死质量浓度随暴露时间的增加而越来越小，72 h和96 h-LC50分别为4.008 mg·L-1和2.683 mg·L-1，安全质量浓度为0.473 mg·L-1。

2.3 Hg2+对中国鲎幼体MT含量的影响

由图1可知，在整个试验过程中，对照组中国鲎幼苗体内MT含量变化范围为(5.20±0.16)～(5.47±0.25) ng·mL-1，表明在没有外源重金属诱导时，幼鲎体内MT含量相对比较稳定。随着Hg2+浓度升高，幼鲎体内MT含量均呈显著变化(P<0.05)。在设定的3个浓度处理中，不同浓度Hg2+均能显著诱导MT产生(P<0.05)，处理组MT含量为对照组的1.152倍～1.716倍，其中以0.025 mg·L-1组72 h的MT诱导量最高，为(8.93±0.16) ng·mL-1。纵向比较可知，在0.005～0.250 mg·L-1Hg2+溶液中暴露24 h的中国鲎幼苗体内MT含量随Hg2+浓度增大而增大，但只有0.250 mg·L-1组显著高于对照组。当实验进行到48、72和96 h，随着Hg2+浓度增大，幼鲎体内MT含量表现为先增后减，均是在Hg2+浓度为0.025 mg·L-1时达到最大值，分别为(7.77±0.21)、(8.93±0.16)和(8.87±0.20) ng·mL-1。该结果表明，不同浓度Hg2+均具有诱导MT的能力，但是当Hg2+浓度过高则会降低诱导能力甚至抑制。

表1 Hg2+急性胁迫下中国鲎幼体死亡率Table 1 Cumulative mortality of larva of T. tridentatus after acute exposure to Hg2+

表2 Hg2+对中国鲎幼体急性毒性及回归分析Table 2 Linear regression analysis of Hg2+ acute toxicity on larva of T. tridentatus

图1 不同浓度Hg2+胁迫下中国鲎幼苗体内金属硫蛋白(MT)含量随暴露时间的变化注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)。Fig. 1 Effects of different concentrations of Hg2+ on metallothionein (MT) content in tissues of larva of T. tridentatusNote: *represents statistical significance (P<0.05) compared to the control.

在实验时间内Hg2+诱导产生MT的含量随着作用时间延长而不同程度升高。在0.025 mg·L-1的Hg2+胁迫下，72 h内幼鲎体内MT含量显著升高(P<0.01)，在72 h时达到最高含量，为(8.93±0.16) ng·mL-1，72 h后变化不显著(P>0.05)，稍有下降。低浓度组(0.005 mg·L-1)和高浓度组(0.250 mg·L-1)胁迫下，幼鲎体内MT含量随着作用时间延长持续增长，在96 h时达到最高含量，分别为(7.66±0.13) ng·mL-1和(8.35±0.35) ng·mL-1。试验开始后24 h内，幼鲎体内MT含量增加量与重金属Hg2+质量浓度呈正相关。24 h时，幼鲎体内MT含量增加量与Hg2+浓度(cHg)的回归方程为Y(ΔMT, ng·mL-1)=6.686X(cHg, mg·L-1)+0.123 (r2=0.940,n=4)。24 h内各试验浓度组幼鲎体内MT含量增加速率为0.006～0.074 ng·mL-1·h-1。试验结果表明，在一定质量浓度的Hg2+胁迫下，幼鲎体内MT含量变化在0～24 h内呈一定的剂量-效应关系。

3 讨论(Discussion)

3.1 Hg2+对中国鲎幼体的急性毒性效应及安全浓度评价

汞是水环境中最常见最危险的重金属污染物之一，低浓度汞就具有较大毒性，进入水环境后随食物链累积，转化为毒性更大的有机态，有机汞不仅危害水生生物，还通过食物链的生物放大和累积作用大量富集[24]。不同海洋节肢动物对汞离子的敏感性存在一定差异，与其他海洋节肢动物早期发育阶段相比，中国鲎幼体对汞的耐受性相对更高。李建军等[25]研究发现Hg2+对黑褐新糠虾(Neomysisawatschensis)的24、48、72和96 h-LC50分别为0.161、0.150、0.150和0.150 mg·L-1。张亚娟等[26]的研究表明，Hg2+对日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)的24、48、72和96 h-LC50分别为0.0602、0.0524、0.0476和0.0380 mg·L-1。赵艳民[27]研究发现，水体汞对中华绒鳌蟹(Eriocheirsisensis)幼蟹的24、48、72和96 h-LC50分别为0.6248、0.5716、0.5332和0.4423 mg·L-1。这些实验结果均远低于本实验结果，说明中国鲎幼苗对于Hg2+的耐受性较强。幼鲎对其他重金属也表现出较高耐受性，在铜和锌的短期急性胁迫中[28]，Cu2+对美洲鲎幼体的72-LC50高达到637 mg·L-1，而Zn2+对美洲鲎幼体的72 h-LC50远超过1 000 mg·L-1。推测该结果源于中国鲎作为一种底栖杂食“活化石”，受到重金属胁迫机会比较大，从而产生一定的抗性所致。鲎的胚胎和幼体可以在潮间带的严峻环境下生存，可以耐受低氧和盐度、温度的极端变化[29]。鲎对污染物的抗性可能与其某些生理机制有关，需要从生理和代谢等角度开展更多研究。

表3 急性水环境毒性分级标准Table 3 Toxicity grading standard for acute toxicity test

本试验结果显示，Hg2+对中国鲎幼苗的安全质量浓度为0.268 mg·L-1，明显高于Hg2+对斑节对虾(Penaeusmonodon)仔虾(0.019 mg·L-1)、南美白对虾(Litopenaeusvanname)幼体(0.123 mg·L-1)和锯缘青蟹(Scyllaserrata)成体(0.068 mg·L-1)等其他海洋节肢动物的安全质量浓度[27]。同时也远高于《渔业水质标准》(GB11607—89)[19]所规定的指标(≤0.0005 mg·L-1)，表明中国鲎幼苗对Hg2+具有很高耐受性。本实验中Hg2+对中国鲎幼苗的安全浓度是在Hg2+单独作用下的结果，天然水体中通常同时存在多种悬浮物、污染物和有机质等[30]。因此，生产实践中可能出现的多种环境因子与Hg2+的联合毒性作用仍需进一步深入研究。

3.2 Hg2+对中国鲎幼苗体内MT含量的影响

MT具有调节微量元素储存、运输和代谢作用，对重金属具有解毒作用。由图1可知，各实验组幼鲎体内MT含量与暴露时间之间均表现出不同程度的正相关，在96 h后，各浓度组幼鲎体内MT含量均显著高于对照组。推测该结果是由于暴露组的幼鲎受到进入机体的重金属离子胁迫后，组织通过合成新的MT，与进入机体内的Hg2+结合，将其转化为无毒形式，从而防止重金属离子对机体的损伤，与对贻贝的研究结果相似[31]。其他研究也得到相似结果，如牡蛎幼虫对重金属等污染物高度敏感，当其受精卵暴露于重金属Cu2+和Cd2+环境中孵化后，幼虫体内MT含量显著增加[32]；凡纳滨对虾肝胰腺中MT含量随金属离子浓度的增加和暴露时间的延长而显著变化(P<0.05)[33]。

由图1可知，在实验开始的前24 h，0～0.250 mg·L-1Hg2+暴露下中国鲎幼苗体内MT含量随Hg2+浓度增大而增大，而48 h后幼鲎体内MT含量随Hg2+增大呈现先升高后下降趋势。这是因为实验前期暴露时间较短，较高浓度的Hg2+有利于诱导MT产生，而随着实验时间延长，幼鲎体内合成的MT与Hg2+趋于饱和。较低浓度的Hg2+胁迫下，组织尚能通过不断合成MT与Hg2+结合，减少对机体的毒性作用。而MT和金属的结合是有限度的[34](1 mol MT分子通常结合7 mol Hg)，过多的重金属进入生物体后，超过MT的结合能力，大量游离态金属离子对生物体产生明显毒性效应，包括MT在内的金属结合蛋白的合成过程也会受到严重抑制，导致MT含量不再增加甚至出现降低的现象[35]。

3.3 幼鲎MT诱导量与Hg2+暴露浓度和暴露时间的相关性分析

Amiard等[36]发现，MT可被某些必需金属元素(Cu和Zn)和非必需金属元素(Cd和Hg等)显著诱导，MT的诱导量与环境中的金属污染水平相关。因此，可以通过野外调查采集海洋生物组织中MT含量，判断海域受重金属污染的程度[37-38]。本研究发现，较低浓度Hg2+即可引发幼鲎体内MT含量显著增加，可见幼鲎MT对水体中Hg2+具有较高敏感性。需要特别指出的是Hg2+浓度与MT含量之间并非始终存在线性关系，只对一定范围的暴露浓度和暴露时间表现为线性响应。

北部湾潮间带滩涂是中国鲎幼体的重要栖息地。熊丹等[39]对北部湾潮间带表层沉积物中汞含量进行检测发现，研究区域各站位潮间带表层沉积物汞含量介于0.025～0.126 mg·kg-1之间，平均值为0.061 mg·kg-1。而海水中汞含量范围为0.013～0.237 μg·L-1，平均值为0.043 μg·L-1[6]，且汞的年际变化呈明显上升趋势[40]，值得关注。因此，可利用幼鲎机体MT指标评价不同潮间带海水环境对于中国鲎种群所造成的生态风险初步评价。本实验揭示室内受控条件下研究幼鲎对重金属Hg2+暴露的响应规律，确定MT对Hg2+的响应特征及线性关系、最佳暴露时间等。因天然海域中容易受到多种环境因素(盐度、温度和其他污染物等)干扰，Hg2+暴露是否与其他环境因素存在相互作用[41]，这些问题需要进一步研究探讨。