城市常见落叶的纤维素高效降解菌种分离

高 乐,惠 璠,郭雅妮,姜 洁

(1.陕西省现代建筑设计研究院,陕西 西安 710048;2.西安工程大学 环境与化学工程学院,陕西 西安 710048)

0 引 言

城市绿化废弃物属于可再生能源,具备良好的经济利用价值,处理得当可解决绿化废弃物的消纳问题,一举两得[1]。目前针对城市绿化废弃物处理的主要途径有焚烧、填埋、堆肥。焚烧产生的大量污染物会造成二次污染,且无法有效利用燃烧产生的热量[2];填埋对于绿化废弃物的处理效果非常有限,不仅占用宝贵的土地资源,且循环周期较长[3];相比而言,城市绿化废弃物的堆肥化处理具备经济、安全的特性,是绿化废弃物资源化利用的重要途径[4]。

落叶是绿化废弃物的主要组成部分,通过微生物降解转化为腐殖质或有机营养物,最终得到腐熟的堆肥产品[5],可作为土壤改良剂、有机肥和栽培基质，完成资源化利用[6]。微生物在城市绿化废弃物堆肥处理中起着至关重要的作用[7],但由于落叶中纤维素含量较高且难降解,导致其堆肥周期一般较长,使大规模进行落叶堆肥处理受到限制[8]。因此,为提高以落叶为主的绿化废弃物堆肥效率、堆肥质量,加快堆肥腐熟，缩短堆肥周期就显得非常必要。而目前的研究仅停留在降解效果的测定和直接利用商业菌种堆肥,鲜有分离有效促进纤维素降解的优势菌为目的的研究[9-10]。

本文以中国北方城市最常见落叶(悬铃木落叶、小叶女贞落叶)为原料,以易得的污水厂剩余污泥、土壤、猪粪、鸡粪等不同菌剂对落叶进行微生物降解,特别针对其中难降解的纤维素类物质进行降解,以期通过分离获得利于堆肥化处理的纤维素高效降解菌种,为缩短绿化废弃物堆肥周期提供基础支持。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料 以中国北方城市常见落叶—悬铃木落叶、小叶女贞落叶为材料(取自西安市市区)。将原材料按要求进行烘干、粉碎(粒径约5 mm，用于降解实验)，研磨、过60目筛，用于各指标测定。

猪粪、鸡粪(取自西安市临潼区某养殖场); 剩余污泥(取自西安市某污水处理站);土壤(取自西安工程大学临潼校区花园)；商品菌剂为液体农富康种植菌液;泔水(取自西安工程大学临潼校区食堂)。

1.1.2 试剂 蛋白胨、酵母膏、羧甲基纤维素钠、琼脂为生化试剂,其余试剂均为分析纯试剂。

1.1.3 仪器 多功能粉碎机(9F-330型,河南省荥阳市永兴机器厂);恒温水浴振荡槽(DKZ-2型,杭州汇尔仪器设备有限公司);高压蒸汽灭菌锅(YX280B型,上海三申医疗器械有限公司);控温消煮炉(KXL1010型,北京京晶科技有限公司);生化培养箱(SPX-250B型,上海市医疗器械批发部);电热恒温干燥箱(DHG-9247A,上海精宏实验设备有限公司);冷冻离心机(Centrifuge 5810R,EPPENDORF公司);紫外分光光度计(V-1100,上海美谱达仪器有限公司);电子天平(ESJ120-4,沈阳龙腾电子有限公司);凝胶电泳仪(DYY-6C 型,北京六一仪器厂);PCR 仪(TP600型,日本 Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 原料组分测定 1) 含水率的测定:采用称重法测定样品含水率。

2) 总有机碳的测定[11]:

C=[0.003(V0-V)CFe/m]×100%

式中:C为样品有机碳质量百分比;V0为空白样滴定消耗的FeSO4体积(mL);V为样品滴定消耗的FeSO4体积(mL);CFe为FeSO4溶液浓度(mol·L-1);m为落叶样品的质量(g);0.003为1/4碳原子的毫摩尔质量(g·mmol-1)。

3) 总氮的测定:称取烘干过筛备用的落叶样品0.500 0 g,用凯氏定氮法在分光光度计210 nm波长处,以无氨水作参比,进行总氮的测定[12]。

4) 纤维素的测定[13]:精确称取烘干过筛备用的样品(18±0.001) g,加入100 mL酸性洗涤剂,煮沸1 h后坩埚过滤,经300 mL热水(90 ℃)反复洗涤,再用丙酮洗涤2～3次,直至滤液呈无色为止;置于烘箱105 ℃烘5 h,冷却后称重。

1.2.2 落叶降解实验 将落叶根据实验要求自然风干,粉碎机破碎至前期实验确定的最佳粒径5 mm左右[14];取约100 g烘干粉碎的落叶放入500 mL锥形瓶称重,加入粒径6～8 mm的级配碎石以防结块,碎石经过自来水浸洗3次,按照落叶的30%加入。

单组分菌剂分别为土壤、污泥、猪粪、鸡粪、购买菌液,双组分菌剂分别为土壤+污泥、土壤+猪粪、土壤+鸡粪、土壤+菌液、污泥+猪粪、污泥+鸡粪、污泥+菌液、猪粪+鸡粪、猪粪+菌液、鸡粪+菌液。物料与菌剂的添加比例为3∶1(质量比),双组份菌剂按照1∶1(质量比)混合,同时设置一组空白对照。将以上物料混匀,利用稀释的泔水调节含水率至50%～60%,具体表现为用手抓起物料,指缝有水渗出,但水不滴落为宜。按照降解物料的1%添加尿素,锥形瓶称重后将样品置恒温振荡培养箱(50 ℃)进行好氧降解实验,每隔72 h取样一次,共取样5次。实验开始后,前3天每隔4 h人工搅拌;其余均在每天早、中、晚固定时间段搅拌以保证物料的供氧和防止物料结块。

1.2.3 纤维素分解菌的分离 以降解效果最佳的菌剂与落叶混合降解15 d的产物为菌种来源。在无菌超净工作台上称取样品1.0 g,稀释法制备10-2～10-6倍的稀释液[15]。

吸取不同梯度稀释液100 μL,加入纤维素分解菌选择培养基中,涂布法进行细菌和真菌分离培养,每个梯度稀释液平行涂布平板3个。将细菌置于30 ℃恒温培养箱中培养24～48 h,观察不同梯度平板中菌落数量及分布情况。挑选菌落分布较均匀的平板,根据不同的菌落形态特征,分别挑取单个菌落,划线接种于新的纤维素分解菌选择培养基上。将纯化2～3次后的菌株接种于纤维素分解菌选择培养基中,放入培养振荡器(转速200 r/min、温度25 ℃)中震荡培养12～24 h。真菌平板于30 ℃倒置培养72 h,观察不同梯度平板中菌落数量及分布情况,筛选出优势数量菌落并且分布均匀的梯度平板。根据不同菌落形态特征,分别挑取单菌落接种到新的纤维素刚果红培养基上纯化2～3次,将纯化后的菌株于30 ℃培养72 h后置于4 ℃冷藏保存。

利用刚果红染色法,根据菌落透明圈出现早晚和大小初步判断菌株产酶情况[16],菌落透明圈数量越多,面积越大,表示该菌种对纤维素的降解效果越好。

1.2.4 纤维素分解菌的鉴定 鉴定方法见文献[17-18]。提取真菌基因组DNA,并以其为模板，选用文献[19]真菌rDNA ITS基因克降引物,扩增菌株的基因序列。反应体系:H2O 17.8 μL,Buffer 3 μL,d NTP 2 μL,Primer1 3 μL,Primer2 3 μL,DNA 模板1 μL,酶0.2 μL;总体积30 μL。反应条件:① 95 ℃， 5 min。② 95 ℃，30 s；55℃，30 s；72 ℃，1 min；35 cycles。③ 72 ℃，10min。④ 12℃，forever。

利用ITS 通用引物对菌株进行PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测[20]。

将含有真菌菌株的PCR产物送至上海天昊生物科技完成后续的菌株测序[21]。

在GenBank上对以上步骤检测的序列进行Blast比对,获得同源性序列,再利用MEGA 5.0 软件构建系统发育树[22]。

2 结果与分析

2.1 落叶混合物成分测定

表1为落叶混合物的成分表。由表1可知,落叶混合物作为降解底物，其C/N为38.35,纤维素含量较高,为48.4%。

表 1 落叶混合物的成分测定Tab.1 The composition determination of fallen leaves mixture

2.2 单组份菌剂对落叶的降解

2.2.1 总有机碳的降解 单组份菌剂降解落叶混合物过程中总有机碳的变化见图1。由图1可以看出,落叶混合物中的总有机碳含量整体呈下降趋势,且发酵前期变化迅速,后期变化逐渐缓慢。分析认为发酵初期微生物活动较后期更为活跃,因此表现出发酵前期总有机碳的含量下降迅速。以落叶为原料的发酵中总有机碳的含量均很高,在发酵第15天时,鸡粪发酵组的总有机碳利用率最高,总有机碳质量分数降至24.81%,其次为商品菌剂发酵组,可降至24.95%。

图 1 单组份菌剂降解落叶过程中总有机碳的变化Fig.1 The change of TOC during fallen leaves degrading by single inoculants

2.2.2 总氮的降解 单组份菌剂降解落叶混合物过程中总氮的变化见图2。由图2可以看出,在发酵原料情况相同,加入不同微生物菌剂后处理的总氮含量出现差异。随着降解时间的延长,总氮含量整体呈现缓慢增加趋势,其中添加剩余污泥菌剂的堆肥,在第15天时总氮含量最高,达到1.72%,其余处理的发酵物中总氮含量有较小差异。所有处理的最终物料中总氮含量均高于原料,是因为降解引起总体积和质量的下降,导致后期总氮含量的上升。

图 2 单组份菌剂降解落叶过程中总氮的变化Fig.2 The change of TN during fallen leaves degrading by single inoculants

2.2.3 C/N的变化 C/N是检验原料腐熟度的一个重要指标,C/N从最初的高于35～40降低到18～20。一般认为其数值达到20以下就达到腐熟,即稳定的程度,此时发酵的碳氮比趋向于微生物菌体的碳氮比。单组份菌剂降解落叶混合物过程中碳氮比的变化见图3。由图3可以看出,降解过程中,C/N总体呈现下降趋势,且变化幅度较大。第9天左右鸡粪对原料的降解就可达到20以下,表示处于腐熟状态,其余的菌剂在降解时间延长至第12天之后,可以降至C/N小于20。

2.2.4 纤维素的降解 单组份菌剂降解落叶混合物过程中纤维素含量的变化见图4。可以看出,随着降解时间的增加,纤维素的含量整体呈现下降趋势,在第15 d时鸡粪发酵组的纤维素含量最低,降至33.1%(降解率可达31.6%),其次为土壤降解组,可降至33.6%。

图 4 单组份菌剂降解落叶混合物过程中纤维素含量的变化

Fig.4 The change of cellulose content during fallen

leaves degrading by single inoculants

综上结果表明,单菌剂实验中,添加鸡粪菌剂的降解效果最佳。原因是鸡粪中含有丰富的蛋白质,蛋白质含量较高时,其中所含的氮元素含量也较其他菌剂高,使其发酵初始的C/N比较低,较低的C/N比有利于原料中纤维素的降解。

2.3 双组份菌剂降解过程中各成分测定

2.3.1 总有机碳的降解 双组份菌剂降解落叶混合物过程中总有机碳的变化见图5。可以看出,落叶中的总有机碳含量整体呈下降趋势,且发酵前期变化迅速,后期变化逐渐缓慢。分析认为发酵初期微生物活动较后期更为活跃,因此表现出发酵前期总有机碳的含量迅速下降。在发酵第15天时,鸡粪+菌液降解组的总有机碳利用率最高,含量降至24.88%,其次为土壤+鸡粪降解组,总有机碳含量降至26.53%。

图 5 双组份菌剂降解落叶过程中总有机碳的变化Fig.5 The change of TOC during fallen leaves degrading by double inoculants

2.3.2 总氮的降解 双组份菌剂降解落叶混合物过程中总氮的变化见图6。可以看出, 原料中在加入不同微生物菌剂后,不同降解处理中总氮含量出现差异。随着降解时间延长,其中总氮含量整体呈现缓慢增加趋势,添加剩余污泥+土壤菌剂的降解组,在第15天时总氮含量最高,达到 1.64%。所有处理的最终物料总氮含量均高于原料,是由于降解使总体积和质量均有下降,导致后期总氮含量的上升。

图 6 双组份菌剂降解落叶混合物过程中总氮的变化Fig.6 The change of TN during fallen leaves degrading by double inoculants

2.3.3 C/N的变化 双组份菌剂降解落叶混合物过程中C/N的变化见图7。可以看出,降解过程中,C/N总体呈现下降趋势,且变化幅度较大。第9天左右,鸡粪+土壤降解组对原料C/N的降解就可达到20以下,表示处于腐熟状态,其余的菌剂在降解时间延长至12 d之后,可以降至C/N均小于20。

2.3.4 纤维素的降解 双组份菌剂降解落叶混合物过程中纤维素含量的变化见图8。可以看出,随着降解时间的延长,纤维素的含量整体呈现下降趋势,在第15天时鸡粪+土壤降解组的纤维素含量降至33.4%(降解率31.0%),其次为污泥+鸡粪降解组的纤维素含量,可降至33.8%,均低于加入单组份鸡粪菌剂的降解效果,说明加入双组分菌剂不利于纤维素的降解,因为菌种过多,相互之间对营养物或环境条件会存在竞争抑制作用[23]。

图 8 双组份菌剂降解落叶过程中纤维素的变化Fig.8 The change of cellulose content during fallen leaves degrading by double inoculants

综上所述,双组份菌剂实验中添加鸡粪+土壤组菌剂的物质降解效果总体最佳。原因是鸡粪中含有丰富的蛋白质,蛋白质含量较高时,其中所含的总氮量也较其他菌剂高,使其降解初始的C/N较低,较低的C/N有利于原料中纤维素的降解;同时土壤中富含降解落叶的菌种,对于纤维素的降解效果较污泥、猪粪更佳;但比较而言,由于菌种之间竞争抑制的缘故,单组分菌剂鸡粪对纤维素的降解效果反而更加有效。

2.4 优势菌落的分离和观察

选取不同菌剂与落叶混合降解15 d的产物为菌种来源,利用刚果红选择培养基在30 ℃恒温培养箱中进行培养。通过观察不同稀释梯度平板中的微生物菌落,发现10-6倍稀释梯度平板中的微生物数量及种类分布较为均匀,菌落独立不重叠。因此,真菌和细菌的分离从10-6倍的稀释梯度平板中挑选并进行分离培养。培养结果如图9所示。

(a) 猪粪 (b) 土壤

(c) 剩余污泥 (d) 鸡粪图 9 不同菌剂中纤维素降解菌的培养

Fig.9 Culture of cellulose degrading microorganisms in different microbial inoculants

观察菌落是否产生透明圈及其大小。透明圈数量越多,面积越大则表示该菌种对纤维素的降解效果越好。从图9可以看出,鸡粪降解组的菌种形成的透明圈个数最多最明显,说明鸡粪菌种中纤维素降解菌对纤维素的降解效果最好。

2.5 菌株的分子生物学鉴定

从前期实验结果可知,无论是单一菌剂,还是双组分菌剂,都表明鸡粪中含有的纤维素降解菌是比较有效的。因此,通过对鸡粪中分离出来的纤维素降解菌纯化培养,并进行分子生物学鉴定,了解落叶中纤维素的高效降解菌种所属,为纤维素高效降解菌种的选择和扩大培养提供目标,以期为绿化废弃物堆肥提供优势微生物菌种。

2.5.1 菌株 PCR 扩增产物结果 图10为菌株的ITS区PCR扩增产物电泳图。图中M为DL5000 DNA Marker; 1,2为菌株PCR产物；3，4为阴性对照。图中显示阴性对照组无条带,而目的菌株的电泳条带在500～750 bp之间,与目的条带大小一致。表明菌株的ITS区扩增正确,可进行测序。

图 10 菌株的ITS区PCR扩增产物电泳图Fig.10 Electrophoresis of PCR amplified products in ITS region of strain

2.5.2 菌株的序列分析 经PCR扩增测序得到长度为530 bp的核苷酸序列,提交Blast,与NCBIGenBank数据库中已发表的核苷酸序列进行同源性比较,结果表明相似性可达到99%以上,再运用MEGA5.0软件包选用邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树[22],确定该菌株为橘青霉属(penicilliumcitrinum)。

橘青霉具有易培养和生长快的优势,可借助菌丝的生长作用大面积插入堆体,利用分泌的胞外水解酶如纤维素酶,对纤维素等有机物进行降解。在绿化废弃物堆肥过程中,可借助添加纤维素高效降解菌缩短堆肥周期,提高堆肥效率。因此,橘青霉是一种有重要应用潜力的纤维素分解菌。

3 结论

1) 单组份鸡粪菌剂降解实验、双组份菌剂降解实验和菌落透明圈实验结果均显示鸡粪菌种中纤维素降解菌对纤维素的降解效果最佳。

2) 以鸡粪菌剂与落叶混合降解15 d的产物为菌种来源,筛选和分离出纤维素高效降解菌种,菌种鉴定结果为橘青霉属(penicilliumcitrinum),具有作为高效堆肥菌的可行性和价值。