Er(Ⅲ)对油菜线粒体的作用

汪冬芳，江博，闫宝亨，刘瑞强，周琴，李大彬，戴捷，*

1. 长江大学化学与环境工程学院，荆州 434023 2. 湖北省生态环境厅荆州生态环境监测中心，荆州 434000

稀土元素因其独特的理化特征，而广泛应用于农业、电子、钢铁和医药等领域[1]。研究表明，较低浓度的稀土元素能够促进种子发芽，刺激植物根部生长，提高农作物的抗性，进而提高农作物产量，而高浓度稀土离子将对农作物生长产生抑制作用[2-3]。随着环境污染的日趋严重以及稀土微肥的广泛使用，土壤中稀土离子含量不断提高，对植物产生毒害作用，并通过食物链进入人体，对人类健康构成威胁，因此有必要探究稀土元素对植物的影响[4]。

线粒体是细胞进行的有氧呼吸场所，为细胞的各项生命活动提供能量。此外，线粒体还可调控细胞程序化死亡，对细胞代谢产生重要影响[5]。研究表明，镧、铈和钆等稀土离子对水稻离体线粒体代谢及呼吸功能表现出抑制作用，高浓度稀土甚至导致线粒体内膜破裂[6]；Dai等[7]的研究表明，稀土镧和铈在低浓度时经体内途径对水稻线粒体代谢活性有促进作用，但高浓度则产生抑制作用。关于稀土元素对线粒体的影响的研究大多集中于轻稀土和中稀土，而对重稀土的研究工作较少。Li等[8]的研究表明，安徽省土壤中铒(Er)含量达到了3.88 mg·kg-1，相对其土壤背景值增加了61.6%，较高浓度的Er会对动植物产生不利影响，本研究重点关注Er(Ⅲ)与植物的相互作用。

以油菜线粒体为对象，采用光谱法和Clark氧电极法研究重稀土离子Er(Ⅲ)对线粒体结构与功能的影响，并且采用透射电子显微镜(TEM)表征了不同浓度Er(Ⅲ)作用下线粒体的微观结构。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

BPN-50CH(UV)恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，中国)；TGL-20M高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，中国)；UV-6100S双光束紫外-可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司，中国)；LS-55荧光光度计(Perkin Elmer，美国)；Clark溶氧电极系统(Pnsatech Instruments Ltd.，英国)；移液器(Eppendorf，德国；BioHit，芬兰)；Sartorius普及型pH计(Sartorius，德国)；微量进样器(海高鸽工贸有限公司，中国)；JEM-100CXⅡ透射电子显微镜(日本电子公司)等。

蔗糖、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、L-半胱氨酸、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、甘露醇、六水合氯化镁、磷酸二氢钾、六水合丁二酸钠、乙酸钾、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、硝酸钾、氯化钾、β-巯基乙醇、六水合氯化铒、牛血清白蛋白(BSA)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPs)鱼藤酮、缬氨霉素、二磷酸腺苷(ADP)和血卟啉(HP)等购自国药集团化学试剂有限公司。

研磨缓冲液(pH=7.5)：0.5 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl、5 mmol·L-1EDTA、0.1% BSA和5 mmol·L-1β-巯基乙醇。洗涤缓冲液(pH=7.5)：0.5 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1MgCl2溶液。悬浮缓冲液(pH=7.5)：0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1Tris-HCl和20 mmol·L-1EDTA。Buffer C (pH=7.5)：250 mmol·L-1蔗糖、20 mmol·L-1HEPES、2 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1KH2PO4、20 mmol·L-1丁二酸钠和1 μmol·L-1鱼藤酮。呼吸耗氧溶液(pH=7.5)：100 mmol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1Tris、10 mmol·L-1MOPs、1 mmol·L-1Na2EDTA、2 mmol·L-1MgCl2、50 mmol·L-1KH2PO4和4 μmol·L-1鱼藤酮。H+渗透性溶液：135 mmol·L-1乙酸钾、5 mmol·L-1HEPES、0.1 mmol·L-1EGTA、0.2 mmol·L-1Na2EDTA、1 μg·mL-1缬氨霉素和2 μmol·L-1鱼藤酮，溶液调至pH=7.1。K+渗透性溶液：13.5 mmol·L-1KNO3、5 mmol·L-1HEPES、0.1 mmol·L-1EGTA、0.2 mmol·L-1Na2EDTA和2 μmol·L-1鱼藤酮，溶液调至pH=7.1。以上溶液与Er(Ⅲ)溶液均采用超纯水配制。

华油杂62，购于华中农业大学种子直销公司。

1.2 实验方法

油菜黄化苗培养：将油菜种子用75%的酒精清洗5～10 s后浸入4% NaClO进行表面消毒5～10 min。已消毒的种子用二次水浸泡10～16 h后置于培养盘中，在22 ℃培养箱中培养15 d，黄化苗长至6～10 cm待用。

油菜线粒体提取：油菜线粒体的提取方法参照文献[9-10]的方法。黄化苗加研磨缓冲液在研钵中捣碎后过滤得到线粒体的粗提取液。将粗提取液在3 100 g转速下离心10 min，随后将离心所得上清液于17 600 g转速下再次离心8 min，得到的沉淀为粗线粒体。线粒体纯化过程主要是将沉淀悬浮于悬浮缓冲液中，再将其均匀铺展在洗涤缓冲液中以17 600g离心8 min，此纯化步骤重复2次得到的沉淀即为线粒体。

线粒体肿胀度测定：将线粒体均匀分散于2 mL Buffer C中，在常温条件下，测定线粒体悬浮液于540 nm波长处的吸光度，检测时间为600 s[11]。

线粒体H+/K+渗透性测定：将线粒体均匀分散于2 mL对应的H+/K+渗透缓冲液中，在常温条件下，测定线粒体悬浮液于540 nm波长处的吸光度，检测时间为600 s[12]。

线粒体膜流动性测定：以HP为探针，采用荧光分光光度计测定不同浓度Er(Ⅲ)对线粒体膜流动性的影响[13]：将线粒体均匀分散到含有6 μmol·L-1HP的2 mL Buffer C中，在激发和发射波长分别为520 nm和626 nm条件下测量线粒体悬浮液荧光各向异性(r)。r的定义如方程(1)所示：

r=(I∏-GI⊥)/(I∏+2GI⊥)

(1)

式中：I∏和I⊥表示激发偏振器与发射偏振器取向分别为相互平行和相互垂直时所测得的偏振发射光强度。G=I∏/I⊥，为仪器光栅的修正因子[14]。

Clark氧电极法：采用Clark氧电极测定不同浓度Er(Ⅲ)作用下线粒体的呼吸耗氧情况。将4 mg·mL-1的线粒体溶解于1 mL的呼吸耗氧溶液中，以5 mmol·L-1丁二酸钠与0.25 mmol·L-1ADP作为呼吸底物，在37 ℃下恒温培养，测定线粒体呼吸状态3(state 3)下的耗氧速率[15]。

TEM表征线粒体超微结构：将含不同浓度Er(Ⅲ)的线粒体在戊二醛/磷酸盐缓冲液中固定30 min后，用磷酸盐缓冲液清洗3次并固定于1%的四氧化锇溶液，经脱水、超薄切片和染色处理后，用TEM表征线粒体形貌[16]。

2 结果(Results)

2.1 Er(Ⅲ)诱导线粒体肿胀

采用紫外-分光光度计测定了不同Er(Ⅲ)浓度下线粒体在540 nm处吸光度，吸光度降低则说明线粒体肿胀[17]。结果如图1所示，不同浓度的Er(Ⅲ)均引起了吸光度不同程度的降低，当Er(Ⅲ)浓度为0～100 μmol·L-1时，吸光度下降程度较小，肿胀程度并不明显；随着Er(Ⅲ)浓度的增大，线粒体肿胀现象越来越明显，当Er(Ⅲ)浓度达到600 μmol·L-1时，吸光度迅速下降至0.32，说明此时线粒体的肿胀现象非常明显。

图1 不同浓度铒离子(Er(Ⅲ))引起油菜离体线粒体肿胀注：a～f表示Er(Ⅲ)浓度分别为0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 1 Swelling of isolated rape mitochondria caused by different concentrations of erbium (Er(Ⅲ))Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.2 Er(Ⅲ)对线粒体膜H+/K+渗透性的影响

Er(Ⅲ)对线粒体内膜H+/K+渗透性的影响均通过去能的线粒体肿胀程度判断。如图2(a)所示，随着Er(Ⅲ)的加入，吸光度下降，线粒体出现了缬氨霉素依赖性的肿胀，这说明Er(Ⅲ)促进了线粒体内膜对H+的渗透作用。如图2(b)所示，随着Er(Ⅲ)浓度的增加，540 nm处吸光度迅速降低，线粒体逐渐膨胀，说明Er(Ⅲ)促进了线粒体内膜对K+的渗透。

图2 不同浓度Er(Ⅲ)对于线粒体内膜H+(a)/K+(b)渗透的影响注：a～f表示Er(Ⅲ)浓度分别为0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 2 Mitochondrial inner membrane permeabilization to H+(a)/K+(b) influenced by different concentrations of Er(Ⅲ)Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.3 Er(Ⅲ)对线粒体膜流动性的影响

线粒体的肿胀通常伴随着线粒体膜流动性的改变，为此检测了不同浓度Er(Ⅲ)作用后的线粒体结合HP的荧光各向异性，荧光各向异性增大表明膜流动性降低[18]。如图3所示，随着Er(Ⅲ)浓度的增大，线粒体荧光各向异性逐渐增大，说明Er(Ⅲ)降低了线粒体膜的流动性。尤其是当Er(Ⅲ)浓度超过50 μmol·L-1后，线粒体的荧光各向异性明显增大，说明高浓度Er(Ⅲ)会明显降低线粒体膜的流动性。

图3 不同浓度Er(Ⅲ)引起线粒体膜流动性的改变注：a～f表示Er(Ⅲ)浓度分别为0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 3 Changes of mitochondrial membrane fluidity caused by different concentrations of Er(Ⅲ)Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.4 Er(Ⅲ)对线粒体呼吸作用的影响

采用Clark氧电极法考察了Er(Ⅲ)对线粒体第3阶段(State 3)呼吸作用的影响。由图4可知，随着Er(Ⅲ)浓度逐渐增大，线粒体呼吸耗氧速率逐渐下降，这说明线粒体呼吸作用减弱，Er(Ⅲ)抑制了线粒体呼吸链的功能。

图4 Er(Ⅲ)对于油菜离体线粒体State 3下呼吸速率的影响注：数字表示加入相应浓度的Er(Ⅲ)后的耗氧率。Fig. 4 Effect of Er(Ⅲ) on the State 3 respiration rate of isolated rape mitochondriaNote: The number indicates oxygen consumption rate after adding corresponding concentration of Er(Ⅲ).

2.5 线粒体TEM图谱

TEM表征线粒体超薄切片的图谱如图5所示。由图5(a)可知，线粒体外膜完整，呈椭圆形，电子密度高，部分区域可以观察到紧凑的嵴。由图5(b)可知，100 μmol·L-1Er(Ⅲ)温育后的线粒体电子密度明显变低，线粒体体积变大，嵴已经很难辨认，这与线粒体发生肿胀的实验结果相符。由图5(c)可知，为500 μmol·L-1Er(Ⅲ)温育后的线粒体外膜有一定程度破坏。研究表明，线粒体可通过线粒体孔道释放细胞色素c调控细胞死亡，当线粒体外膜受损，线粒体内的细胞色素c释放过多，将导致细胞死亡[19]。

图5 0 μmol·L-1 (a)、100 μmol·L-1 (b)和500 μmol·L-1 (c) Er(Ⅲ)温育的线粒体超微结构的TEM表征Fig. 5 TEM images of the ultra-structure of mitochondria incubated with Er(Ⅲ) of 0 μmol·L-1 (a), 100 μmol·L-1 (b) and 500 μmol·L-1 (c)

3 讨论(Discussion)

线粒体悬浮液在540 nm处的吸光度变化可以表征Er(Ⅲ)对线粒体肿胀程度的影响，吸光度下降表明线粒体肿胀。研究表明，Er(Ⅲ)浓度的增加引起了吸光度不同程度的降低，说明线粒体基质扩张，线粒体肿胀。在较高浓度Er(Ⅲ)诱导下，线粒体内膜的通透性增大，大量溶质进入线粒体基质，胶体渗透压增加，线粒体发生肿胀，这可能会进一步导致线粒体外膜破损。

当线粒体基质体积变大时，内膜嵴展开，部分蛋白的构象可能会发生变化，导致膜流动性变化[22]。有报道称，HP会集中在内膜上的特殊极性及蛋白区域，通过HP标记线粒体，测量其荧光各向异性变化可反映线粒体膜流动性的改变。如图3所示，荧光各向异性的变化表明，随Er(Ⅲ)浓度增加，线粒体膜的流动性降低，说明线粒体内膜上的部分蛋白质发生变化，这可能会造成线粒体功能紊乱。

以上研究结果表明，Er(Ⅲ)诱导线粒体发生了膜渗透性转化(MPT)，TEM图谱观察到在较高浓度Er(Ⅲ)作用下，线粒体外膜明显受损，这进一步验证了MPT的发生。MPT会引起线粒体正常功能出现异常，而线粒体最重要的功能之一是通过呼吸作用为细胞供能。State 3下，线粒体通过电子传递链和ATP合成酶，将ADP合成为ATP，这个过程主要受到呼吸链和ATP合成酶的控制。Clark氧电极实验结果表明，较高浓度的Er(Ⅲ)会抑制线粒体呼吸作用，影响线粒体呼吸链功能，破坏了线粒体功能。本研究结果证实，较高浓度的Er(Ⅲ)对于油菜线粒体的结构与功能均具有破坏作用。