再生水回用的环境系统中抗生素、抗药菌与抗性基因分布的研究进展

杨肖肖，张昱，李久义，田秀君

1. 北京交通大学市政与环境工程系，北京 100044 2. 中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085 3. 中国科学院大学，北京 100049

将城市污水厂的污水经处理后再生回用是缓解城市水资源短缺的主要措施之一[1-2]。典型的城市景观水体补给、农田灌溉和城市绿化是城市污水再生回用环境[3]。医院、制药厂等废水中含有抗生素和抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)[4]，污水处理厂(wastewater treatment plants, WWTPs)传统的生物处理方法主要用于去除固体、有机物和营养物质，WWTPs并未设有抗生素去除工艺，在生物处理单元残留的抗生素，促进了微生物抗药菌(antibiotic-resistant bacteria, ARB)的选择以及ARGs的传播[5-6]。Gao等[7]研究了WWTPs出水中抗性基因的分布，检测到tet(O)、tet(W)和sulⅠ基因丰度分别为9.1×103、5.1×103和1.1×104copies·mL-1。Chen和Zhang[8]发现污水处理厂深度处理工艺能有效去除有机物，而对ARGs的去除却有高丰度的残留，四环素类(tet)和磺胺类(sul)抗性基因的丰度分别为1.2×104～2.5×104copies·mL-1和6.6×105～3.1×106copies·mL-1，研究证实，WWTPs是ARB和ARGs重要的蓄积库[8-9]。目前，Pruden[9]将抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物，有关其在环境中传播和污染等报道日益增多。转座子、质粒和整合子等移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)与ARGs的关注也越来越多，尤其，Ⅰ型整合子(Class Ⅰ integrase,intl1)在某种程度上可以反映人类活动对ARGs污染水平和分布格局的影响，同时表征不同ARGs在环境中的传播扩散规律，从而评估ARGs的潜在生态风险[10]。对于新型污染物抗生素和ARGs，在再生水灌溉时可能会将ARB、携带质粒或移动遗传元件的ARGs转移至土壤中[11]，并通过基因的垂直转移(vertical gene transfer, VGT)和水平转移(horizontal gene transfer, HGT)使ARGs在土壤中传播和扩散[12-13]。再生水回用产生的病原菌健康风险令人担忧。因此，有必要对再生水回用的环境系统中抗生素残留、抗药菌和抗性基因影响进行归纳与分析，以及探讨影响抗生素抗性基因传播扩散的主要因素，以期为再生水灌溉的风险控制和资源化利用提供科学依据。

1 城市水循环中再生水的耐药性迁移(Migration of antibiotic resistance in urban water cycle of reclaimed water)

城市水循环是细菌的主要栖息地和繁殖介质[14]，ARB与ARGs在传播方面起着至关重要的作用。再生水在城市水循环过程中主要用途是处理后回用。首先，城市居民污水、医院和工业废水等经工艺处理后，达到回用标准，回用至农田、地表水环境或工业生产过程中。再生水出水中ARB和ARGs浓度相比进水已有大幅降低，但是，ARB和ARGs浓度相比土壤和自然水体却高很多，由于再生水中残留的抗生素和ARGs的不断释放，可能导致ARGs在受纳环境中繁殖和传播[15-16]，从而增强耐药性。因而，国内外研究者开展了土壤[17]、农田[18]和城市河流[19]中ARB和ARGs的调查研究，残留抗生素使微生物产生选择性压力，促进微生物对抗生素的耐药性增殖[20]。由图1可知，人群暴露于残留有抗生素、ARB以及ARGs的再生水的途径有多种：(1)由景观娱乐水体的暴露，如城市景观公园水上划船、游泳直接接触再生水等[21]；(2)工业中使用再生水的生产线上，人可接触到再生水形成暴露；(3)种植在受抗生素和ARGs污染的土壤中的作物，可检测到一定质量浓度的抗生素及抗性基因[11,22]，进而由食物链传播使人体产生暴露。

图1 再生水循环示意图以及抗生素抗性选择、抗药菌传播和控制重要环节的地点或过程Fig. 1 The schematic diagram of the water cycle of reclaimed water and the location or process of the important links of antibiotic resistance selection, antibiotic-resistant bacteria transmission and control

2 再生水回用环境系统中抗生素、抗性基因和抗药菌污染现状(Occurrence of antibiotics, ARGs, ARB in environmental system with reclaimed water irrigation)

2.1 再生水回用环境系统中抗生素抗性基因污染现状

再生水中检测到了不同浓度的抗生素，而且再生水浇灌城市公园使其土壤中残留的抗生素抗性基因增加了99.3倍～8 655.3倍[23]。Gao等[7]在污水处理厂的出水中检测到磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMX)和红霉素(erythromycin, ERY)的浓度分别为0.1～0.6、0.1～0.5和0.1～0.3 μg·L-1。Leung等[24]在中国香港污水处理厂的出水中检出头孢氨苄(cefalexin, CFL)和氧氟沙星(ofloxacin, OFX)，其检出浓度范围分别为0.2～5.1 μg·L-1和0.1～9.9 μg·L-1。Wang等[25]调查了北京市再生水浇灌公园土壤中抗生素残留，检测到的四环素总浓度为12.7～145.2 μg·kg-1，强力霉素(doxycycline, DXC)和4-差向四环素盐酸盐(4-epianhydrochlortetracycline, EACTC)在所有的土壤样品中都有检出，浓度范围分别为1.8～107.1 μg·kg-1和1.3～5.1 μg·kg-1，研究表明，再生水灌溉增加了公园土壤中抗生素浓度。污水厂出水排入地表水，磺胺类和四环素类基因的检出率最高，丰度分别达到2.5×100～108.26copies·mL-1和9.65×10-7～100copies/16S rRNA[26]。也有研究表明，残留的抗生素浓度和ARGs的丰度，与再生水的补给频率和水量有关，一次灌溉，ARGs水平没有随时间变化，然而，当用废水二次重复灌溉时，可检测出高浓度的ARGs[25]。Wang等[25]用再生水浇灌的公园土壤，构建sulⅡ和intl1基因克隆文库，将测定的目的基因片段序列，在Genebank中用BLAST功能与基因库进行相似性比对，发现与人类致病菌序列同源性分别为95%～100%和94%～100%，同时sulⅡ基因和intl1基因也可存在于一些致病菌中，这使得sulⅡ进一步向致病菌中传播，进而再生水回用至受纳环境对公众健康产生潜在的危害[19,27]。

2.2 再生水回用环境系统中抗药菌污染现状

目前，尚未有再生水回用的受纳环境中ARB的研究，研究集中在微生物菌落结构演变的研究，而针对天然水体、污水厂出水受纳河流等ARB研究甚多，在污水厂出水排放到的环境中检测到ARB浓度范围为103～104CFU·mL-1。对氨苄西林(51.5%)、链霉素(43.3%)、四环素(40.5%)、庆大霉素(30.2%)和环丙沙星(21.9%)耐药率较高。表2对比分析了受纳环境中，不同国家和地区ARB污染分布，在抗药异养生物中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌和沙门氏菌最为常见。Ham等[30]研究日本某河流耐药性大肠杆菌的分布，耐药大肠杆菌的浓度表现出较大的时空变化，支流和下游的浓度高于上游和中游，指出多重耐药大肠杆菌是评价耐药扩散、水质恶化和公共卫生风险潜力的有效指标。Su等[31]从东江流域38个采样点分离到3 456株大肠杆菌，89.1%的菌株耐药，87.5%的菌株对至少3种抗生素耐药，其中，各抗生素的耐药菌株比例分别为氨苄西林43.3%、哌拉西林35%、链霉素56.3%、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶40.6%、四环素60.1%和甲氧苄啶41.6%。Ayandiran等[32]研究尼日利亚人为污染的某河流细菌的耐药性模式，分离的微生物包括属内的微生物芽孢杆菌、假单胞菌、链球菌、变形杆菌和葡萄球菌，从水样中分离的微生物浓度为9.41×103～1.56×104CFU·(100 mL)-1，沉积物中，微生物浓度范围为2.55×104～1.43×105CFU·g-1，芽孢杆菌对环丙沙星、氯霉素、链霉素和阿莫西林耐药，链球菌对红霉素、环丙沙星、复方新诺明、头孢曲松、氯霉素、链霉素和阿莫西林具有耐药性，而且假单胞菌对上述抗生素的耐药率为100%，链球菌、葡萄球菌和芽孢杆菌的耐药率为40%～90%，以上研究结果表明，ARB的多重耐药性与抗生素长期暴露相关，而且可通过质粒或转座子介导在细菌间进行传播。

表1 再生水回用环境系统中抗生素残留和抗性基因(ARGs)分布Table 1 Distribution of antibiotic residues and antibiotic resistance genes (ARGs) in reclaimed water irrigation system

3 抗生素和抗性基因在再生水回用的环境系统中传播(Transmission of antibiotics and ARGs in environmental system of reclaimed water irrigation)

经WWTPs深度处理后，抗生素选择压力不断增加，诱导环境ARGs在宿主细胞中增殖，并水平转移到包括ARB在内的其他菌株，最终通过食物链转移到人类。众多的研究证实，ARGs具有较高的移动性，主要是通过HGT机制大大增加了ARGs在不同微生物间传播扩散的频率，接合转移的载体主要是可自主转移的质粒(self-transmissible plasmid)和接合性转座子(conjugative transposon)；转化过程是胞外ARGs被处于感受态的受体菌摄入体内，并在受体菌内整合表达，使其获得抗性的过程，如图2所示。目前，针对再生水回用环境系统中耐药性的传播研究甚少，而对未处理的废水长期灌溉的土壤、粪肥施用的土壤中抗生素抗性基因的研究则较多[44]。研究证实，再生水浇灌的公园土壤中TnpA-02基因普遍存在，intl1与所研究的抗生素抗性基因(tetG、tetW、sulⅠ和sulⅡ)显著相关，intl1在ARGs的传播扩散中起作用[28]。Bengtsson-Palme等[45]使用宏基因组测序技术在喹诺酮抗生素生产废水污染的湖泊中检测到26种已知质粒和21种新型质粒。Binh等[46]对15个猪粪样品中的质粒进行系统研究，发现了81个质粒，包含IncN、IncW、IncP-1和pHHV216等类型，并在这些质粒上检测到阿莫西林和磺胺类抗性基因。另外一项研究，通过高通量测序技术，检测到污水处理厂细菌携带了最新发现来源于临床分离物的抗性基因，这表明了临床和污水处理厂细菌之间的遗传交换，这些新发现的抗性基因存在于质粒上，且被释放到环境中，进而增加了环境细菌的进一步传播[47-48]。

图2 抗生素、抗药菌和抗性基因在受纳环境中迁移途径与传播Fig. 2 Migration and transmission of antibiotics, antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in the receiving environment

表2 受纳环境中抗药菌种类与分布特性Table 2 Distribution and species of antibiotic-resistant bacteria in the receiving environment

续表2菌株Strains地区Area抗药菌耐药性比例(%)Percentage of resistant strains (%)文献Reference肠杆菌科Enterobacteriaceae珠江(中国)Pearl River (China)氨苄西林(AMP) (55%)、氯霉素(CHL) (10%)、环丙沙星(CIP) (7%)、左氧氟沙星(LEV) (5%)、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT) (15%)、甲氧苄啶(TMP) (20%)、四环素(TET) (19%)Ampicillin(AMP) (55%), chloramphenicol (CHL) (10%), ciprofloxacin (CIP) (7%), levofloxacin (LEV) (5%), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT) (15%), trime-thoprim (TMP) (20%), tetracycline (TET) (19%)[38]城市景观水(中国)Urban recreational water (China)盘尼西林(PEN)(耐药指数5.6)、氨苄西林(AMP)(耐药指3.5)、万古霉素(VAN)(耐药指数3.0)、红霉素(ERY)(耐药指数1.8)、庆大霉素(GEN)(耐药指数0.12)、氯霉素(CHL)(耐药指数0.17)Penicillin (PEN) (antibiotic resistance index 5.6), ampicillin (AMP) (antibiotic re-sistance index 3.5), vancomycin (VAN) (antibiotic resistance index 3.0), erythromy-cin (ERY) (antibiotic resistance index 1.8), gentamicin (GEN) (antibiotic resistance index 0.12), chloramphenicol (CHL)(antibiotic resistance index 0.17)[3]微球菌Micrococcus芽孢杆菌Bacillus链球菌Streptococcus faecium金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus假单胞菌Pseudomonas河流(尼日利亚)River (Nigeria)阿莫西林(AMX) (100%)、头孢曲松(CFR) (80%)、氯霉素(CHL) (100%)、环丙沙星(CIP) (100%)、磺胺甲基异恶唑(COT) (80%)、培氟沙星(PEF) (80%)、氧氟沙星(OFL) (20%)、红霉素(ERY) (60%)、庆大霉素(GEN) (60%)、链霉素(STR) (100%)Amoxicillin (AMX) (100%), ceftriaxone (CFR) (80%), chloramphenicol (CHL) (100%), ciprofloxacin (CIP) (100%), cotrimoxazole (COT) (80%), pefloxacin (PEF) (80%), ofloxacin (OFL) (20%), erythromycin (ERY) (60%), gentamicin (GEN) (60%), streptomycin (STR) (100%)阿莫西林(AMX) (100%)、力白汀(AUG) (100%)、头孢曲松(CFR) (100%)、氯霉素(CHL) (25.6%)、环丙沙星(CIP) (100%)、磺胺甲基异恶唑(COT) (100%)、庆大霉素(GEN) (100%)、呋喃妥因(NI) (100%)、氧氟沙星(OFL) (100%)、培氟沙星(PEF) (100%)、四环素(TET) (100%)Amoxicillin (AMX) (100%), augmentin (AUG) (100%), ceftriaxone (CFR) (100%), chloramphenicol (CHL) (25.6%), ciprofloxacin (CIP) (100%), cotrimoxazole (COT) (100%), gentamicin (GEN) (100%), nitrofurantoin (NIT) (100%), ofloxacin (OFL) (100%), pefloxacin (PEF) (100%), tetracycline (TET) (100%)[32]总大肠菌群Total coliform河流(马来西亚)River (Malaysia)氨苄西林(AMP) (80.5%)、氯霉素(CHL) (22%)、环丙沙星(CIP) (7.7%)、庆大霉素(GEN) (30.8%)、盘尼西林(PEN) (96.4%)、四环素(TET) (47.8%)Ampicillin (AMP) (80.5%), chloramphenicol (CHL) (22%), ciprofloxacin (CIP) (7.7%), gentamicin (GEN) (30.8%), penicillin (PEN) (96.4%), tetracycline (TET) (47.8%)[36]异养菌Heterotrophic bacteria河流(中国)River (China)河流(波兰)River (Poland)河流(中国)River (China)磺胺类(SUL) (81.3%)、四环素类(TCs) (38.6%)Sulfonamides (SUL) (81.3%), tetracyclines (TCs) (38.6%)强力霉素(DXC) (1.9%)、土霉素(OTC) (6.4%)Doxycycline (DXC) (1.9%), oxytetracycline (OTC) (6.4%)万古霉素(VAN) (11.7%)Vancomycin (VAN) (11.7%)[39][40][41]革兰氏阴性菌Gram negative bacteria饮用井水(非洲)Drinking well (Africa)氨苄西林(AMP) (59%)、阿莫西林克拉维酸(ACV) (45.8%)、氯霉素(CHL) (15.7%)、强力霉素(DXC) (3.6%)、庆大霉素(GEN) (19.3%)Ampicillin(AMP) (59%), Amoxicillin clavulanic acid (ACV) (45.8%), chloram-phenicol (CHL) (15.7%), doxycycline (DXC) (3.6%), gentamicin (GEN) (19.3%)[42]

续表2菌株Strains地区Area抗药菌耐药性比例(%)Percentage of resistant strains (%)文献Reference革兰氏阴性杆菌Gram negative rods河流和地下水(孟加拉)River and groundwater(Bengal)氨苄西林(AMP) (63.9%)、阿奇霉素(AZM) (18%)、氯霉素(CHL) (5.1%)、环丙沙星(CIP) (8.8%)、红霉素(ERY) (41.4%)、呋喃唑酮(FR) (87.2%)、庆大霉素(GEN) (14.8%)、萘啶酮酸(NA) (42.7%)、新霉素(NE) (31.1%)、诺氟沙星(NX) (14%)、多粘菌素(PB) (23.1%)、四环素(TET) (16.2%)Ampicillin (AMP) (63.9%), azithromycin (AZM) (18%), chloramphenicol (CHL) (5.1%), ciprofloxacin (CIP) (8.8%), erythromycin (ERY) (41.4%), furazolidone (FR) (87.2%), gentamicin (GEN) (14.8%), nalidixic acid (NA) (42.7%), neomycin (NE) (31.1%), norfloxacin (NX) (14%), polymyxin (PB) (23.1%), tetracycline (TET) (16.2%)氨苄西林(AMP) (13.3%)、红霉素(ERY) (8.3%)、呋喃唑酮(FR) (66.7%)、新霉素(NE) (3%)、诺氟沙星(NX) (21%)、多粘菌素(PB) (13.3%)Ampicillin (AMP) (13.3%), erythromycin (ERY) (8.3%), furazolidone (FR) (66.7%),neomycin (NE) (3%), norfloxacin (NX) (21%), polymyxin (PB) (13.3%)氨苄西林(AMP) (41.6%)、庆大霉素(GEN) (41.6%)、萘啶酮酸(NA) (41.6%)、多粘菌素(PB) (41.6%)Ampicillin (AMP) (41.6%), gentamicin (GEN) (41.6%), nalidixic acid (NA) (41.6%), polymyxin (PB) (41.6%)[43]

4 再生水深度处理工艺对抗生素和抗性基因的去除(Removal technologies of antibiotics and ARGs in advanced treatment process of reclaimed water)

目前，再生水处理技术主要有氯消毒、紫外消毒、微滤/超滤膜、光催化氧化和臭氧氧化技术等[49]。表3汇总了再生水处理技术和工艺对ARB和ARGs的去除效果和特点。膜过滤对部分ARB和ARGs有良好的处理效果；氧化技术属于化学处理技术，虽然很多化学处理技术对ARB和ARGs有很好的去除效果，但是没有选择性，耗能和成本也相对较高。紫外消毒技术使耐红霉素和四环素异养菌的浓度分别减少为(1.4±0.1) CFU·mL-1和(1.1±0.1) CFU·mL-1，同时对红霉素和四环素类基因丰度分别去除(3.0±0.1) log和(1.9±0.1) log[50]。经氯消毒处理后，抗性基因mexF、blaTEM、aphA2和ermA的丰度及整合子丰度增加，而对sulⅠ有明显的去除效果[51]。对臭氧消毒技术而言，臭氧浓度为3 mg·L-1时，ARB和ARGs的去除率在90%以上，进一步研究发现，催化剂的加入缩短了接触时间，ARB和ARGs的去除达2 log。不同孔径的微滤膜和超滤膜能截留出水中ARGs(vanA和blaTEM)，孔径分别为1.0×105、1.0×104和1.0×103Da的超滤膜平均去除1.7、4.9、>5.9个数量级的ARGs，0.45 μm和0.1 μm的微滤膜只能去除不到1个数量级的ARGs[52]。

5 结论与展望(Conclusions and prospects)

抗生素和ARGs的污染具有特殊性，其传播对人类健康和生态系统均会造成危害，目前，再生水回用的环境系统中抗生素、ARB和ARGs的研究大多集中在回用农业土壤和城市公园景观水体。研究更多关注ARGs和常用抗生素残留浓度的变化及ARB的耐药性变化，但对再生水补给量和补给频率对受纳水环境中ARB的演变与耐药动态变化的研究较少。再生水补给对生态水环境是否安全仍未有定论。针对上述内容，建议今后研究从以下几方面展开。

(1)WWTPs深度处理系统工艺参数(臭氧浓度、消毒剂量等)对ARB和ARGs去除的影响，探讨去除的最佳耦合条件。

(2)再生水中抗生素一般不是单独存在，往往伴随着金属离子，因此，应加强研究复合污染物共同作用下，ARB及ARGs所受的影响。同时，需研究新一代抗生素在受纳水体环境中的赋存及风险。

(3)考察再生水回用的受纳环境中可培养的ARB以及ARGs演变的影响因素，从城市节水安全方面考虑，评价再生水回用的耐药性风险。

表3 深度处理工艺对ARB和ARGs的处理效果Table 3 Effect of advanced treatment process on ARB and ARGs removal

续表3工艺Treatment process去除机制Mechanisms of disinfectionARBARGs去除RemovedUV紫外线易穿透细菌细胞膜和细胞质,导致胞嘧啶或胸腺嘧啶被吸收,或细菌胞内和胞外的光敏物质受紫外光诱导产生活性氧,活性氧氧化细胞膜、蛋白质和核酸等,使得细菌失活UV light readily penetrates the relatively UV-transpar-ent structures within the bacterial cell envelope and cytoplasm, where it ab-sorbed cytosine and thy-mine, and the intracellular and extracellular photosensi-tive substances produced re-active oxygen species, which oxidized cell membrane, protein and nucleic acid, making the bacteria inacti-vated耐红霉素菌(2 500±500) CFU·mL-1Erythromycin-resistant bacteria (2 500±500) CFU·mL-1耐四环素菌(290±76) CFU·mL-1Tetracycline-resistant bacteria (290±76) CFU·mL-1ereA(3.5×105 copies·L-1),ereB(7.1×103 copies·L-1),ermA(1.8×103 copies·L-1),ermB(3.3×103 copies·L-1)四环素抗药菌(5%)是紫外线消毒前的与耐红霉素菌相比,耐四环素菌对紫外线的耐受性更强The proportion of tetracycline-resistant(5%) was nearly double oftion, tetracycline-resistanttolerance to UV irradiationromycin-resistant bacteria[50,55低紫外线剂量(8 mJ·cm对接合转移频率影响不大,紫外线照射,仅减少细菌数量但不改变细胞通透性;低氯剂量显著提高了2～5倍的共转移频率Low UV doses (up to 8 mJence on the frequency of UV exposure only decreasedbut did not change the cellrine doses (up to 40 mg Clpromoted the frequency of～5 fold[58]UV254 nm辐射,降低log(2.0±0.3)UV254 nm radiation, reduced log(2.0±0.3)16S rRNA基因降低98.7%16S rRNA gene reduced by 98.7%臭氧和紫外降低了2 logrRNA和intl1基因丰度,肠杆菌科和肠球菌,丰度可降低在接触时间为30 min后,低于检测限After disinfection (chlorinationdance of the different microbiologicalper volume of wastewaternits of 16S rRNA and intlgi. For total heterotrophs,terococci, the abundance wasunits, and values were closequantification for ARG, aftermin of chlorination or UV[60

续表3工艺Treatment process去除机制Mechanisms of disinfectionARBARGs去除Removed臭氧氧化Ozonation臭氧氧化细菌磷酸酯层和脂多糖中的碳碳不饱和键、细胞膜和细胞壁中的肽聚糖、蛋白质上的氨基酸,溶解细胞膜和细胞壁,细胞的通透性增强,臭氧进入细胞,穿过细胞质与核酸物质发生反应使DNA失活Ozone oxidized carbon-carbon unsaturated bonds of bacterial phosphate ester layer and lipopolysaccha-ride, peptidoglycan and ami-no acids, dissolved cell membrane and cell wall, which enhanced permeabili-ty; ozone passed through the cytoplasm and reacted with nucleic acid substances to inactivate DNA3 mg·L-1臭氧浓度下,ARGs降低90%以上;过硫酸盐臭氧生成(mg·min)·L-1和18.47 (mg催化剂的加入缩短了接触时间,实现了More than 3 mg·L-1 ozoneover 90% of ARB and ARGs.fate yielded 15.87 (mg·min)min)·L-1 catalyst, which reducedneeded to achieve 2-log removal[60,63臭氧氧化降低log(2.1±0.5)Ozonation led to log reduction values of 2.1±0.516S rRNA基因降低98.7%Ozonation removed 98.7% of the gene 16S rRNA臭氧接触时间(60 min),微生物的活性低于限值(0.5 CFU·(100 mL)-1);接触和blaTEM基因的从log (4.2范围,去除率为99.99%For a longer ozone exposuremicroorganisms were inactivatedthe limit of quantification (0.5A contact time of 30 min ledging from 4.2±0.5 to >6.7blaTEM genes, correspondingof 99.99%[53]