虞 炜 蔡善保
胃癌是全球范围内发病率第4的恶性肿瘤,其病死率在癌症相关死亡中排名第2[1]。尽管近些年在胃癌的综合治疗方面取得了一些进展,但胃癌患者的预后仍较差,5年生存率低于25%[2]。此外,大多数患者在确诊时已处于中晚期,这也是导致胃癌患者预后不良的重要因素[3]。人过氧化物氧化还原酶-1(peroxiredoxin-1,PRDX1)是过氧化物氧化还原酶蛋白(peroxiredoxin,PRDX)家族成员,其在对抗活性氧簇(reactive oxygen species , ROS)、抗氧化过程中发挥关键作用。PRDX1的活性可涉及细胞分化、细胞凋亡和增殖等生物过程,以及可参与多种人类疾病的发生发展[4]。有研究表明,PRDX1可以在不同类型的肿瘤中发挥不同的作用,如在乳腺癌[5]、骨肉瘤[6]中作为抑癌基因发挥作用,也可在胰腺癌[7]、结直肠癌[8]中作为促癌基因发挥作用。但目前为止,PRDX1与胃癌之间的关系尚未明确。本研究首先在mRNA和蛋白水平上检测胃癌和癌旁组织中PRDX1的表达情况,结合患者临床病理资料和随访资料,评估PRDX1能否成为胃癌的早期诊断及预后评估的新型生物学指标。
1.1 材料收集 2018年5月份就诊安徽省肿瘤医院并首次确诊的21例胃癌患者的术后胃癌与癌旁组织新鲜标本;同时收集2012年1月至2013年12月在安徽省肿瘤医院就诊并首次确诊为胃癌的105例患者术后临床病理切片及病理学资料,涉及临床病理的105例患者中有69例男性和36例女性,平均年龄为(68.02±23.71)岁。根据第七版国际抗癌联盟的TNM分期标准确定肿瘤的病理分期[9],Ⅰ-Ⅱ期的66例,Ⅲ-Ⅳ期的39例,所有患者术前均未接受过放疗或化疗。
1.2 实时荧光 定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)用Trizol从21例新鲜胃癌和癌旁组织中提取总RNA,使用cDNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green定量PCR试剂盒(Bio-Rad)和C1000热循环仪检测PRDX1在组织中的mRNA表达水平。PCR引物序列如下:Human PRDX1,正向5’-CCACGGAGATCATTGCTTTCA-3’和反向5’-AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT-3’。每个样品一式三份进行测试,以GAPDH表达作为内参。cDNA逆转录试剂盒序列号:RR037A,购于中国大连TaKaRa公司;SYBR Green定量PCR试剂盒序列号:1708880,购于美国加州bio-rad公司。
1.3 蛋白质印迹法 将从新鲜的21例胃癌患者组织中提取的细胞在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中洗涤后,在4℃以RIPA缓冲液(20 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl,10%甘油,50 mM EDTA,1%Triton X-100)裂解30 min。然后收集全细胞提取物并在4℃ 12 000 r/min下离心15 min。之后,用移液枪除去上清液,使用Bradford法检测蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离等量的裂解物蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。之后,用5%脱脂牛奶封闭膜并在4℃下以PRDX1一抗孵育过夜。第2天,将膜在二抗中孵育,最后通过电化学发光系统显像。
1.4 免疫组织化学和评分 对从病理科调取的105例胃癌和癌旁组织标本的石蜡切片进行PRDX1免疫组化分析。将胃癌和癌旁组织的蜡块切片制成4 μm厚的石蜡切片,使用两步法免疫组织化学技术检测抗原的表达情况。室温下将石蜡切片脱蜡脱苯后,在过氧化氢溶液中放15 min以抑制内源性过氧化物酶的活性。用磷酸盐缓冲液(3次×3 min)洗涤后,在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复。再次用PBS(3次×3 min)洗涤后,在室温下用PRDX1单克隆抗体(Abcam,Cambridge,MA,美国)染色约2 h。然后,用PBS(3次×3 min)再次洗涤。在切片上滴加通用型二抗,后室温孵育约15 min后,用磷酸盐缓冲液再洗涤(3次×3 min)。最后,每个切片在室温下用50 μL DAB显色液处理约3~10 min,并用显微镜观察,PBS洗涤后,再次以苏木精复染。最后脱水,封片。
根据细胞的染色强度对每张切片进行评分。根据肿瘤细胞的染色比例评分为0(1%)、1(2%~25%)、2(26%~50%)、3(51%~75%)和4分(≥76%)。根据染色强度评分为0(无染色)、1(弱)、2(中等)和3分(强)。最终表达的结果通过“染色比例百分比得分×强度得分”来确定,总分为12分,0~3分被认为是低表达,4~12分被认为是高表达。所有染色分值的确定由2位病理学专家评估。
2.1 PRDX1在胃癌及癌旁组织中表达的比较 在胃癌组织中,qRT-PCR结果显示PRDX1mRNA表达水平的ΔCT值高于癌旁组织[(5.62±0.42)比(2.16±0.42),t=14.550、P<0.001]。蛋白质印迹法结果显示PRDX1在胃癌组织中的蛋白表达水平也高于配对的癌旁组织。见图1。同时,从调取的105例有随访信息和临床病理学资料的病理切片免疫组化分析结果得出,在大部分胃癌组织中PRDX1蛋白高表达(62/105)。见图2。
图1 Western Blot检测21例胃癌和癌旁组织中PRDX1蛋白表达水平
图2 免疫组织化学染色检测PRDX1在胃癌(A)和癌旁组织(B)中的表达情况(免疫组化×10)
2.2 PRDX1蛋白的表达与临床病理参数的关系对比 胃癌的低未分化与高中分化,T3+T4与T1+T2浸润深度,有与无淋巴结转移,及TNM III-IV与Ⅰ~Ⅱ分期,前者PRDX1的蛋白表达水平偏高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.3 PRDX1的蛋白表达与预后的关系 Kaplan-Meier生存曲线进一步评估PRDX1的蛋白表达与患者总生存时间(overall survival, OS)及无病生存时间(disease-free survival, DFS)的关系。结果表明,PRDX1的蛋白高表达患者的总生存时间及无病生存时间均低于PRDX1的蛋白低表达的患者。见图3。
表1 PRDX1在胃癌中的表达与胃癌患者的临床参数之间的关系(例)
图3 Kaplan-Meier生存曲线分析105例胃癌患者的OS和DFS与PRDX1的蛋白表达情况的关系
2.4 早期胃癌患者淋巴结转移影响因素的多因素分析 将患者总生存时间、无病生存时间作为因变量,患者性别(男性=0,女性=1)、年龄(21~60岁=0,60~85岁=1)、肿瘤大小(0.3~5.0=0,5.1~9.0=1)、肿瘤分化程度(高中分化=0,低未分化=1)、淋巴结转移(无=0,有=1)、浸润深度(T1+T2=0,T3+T4=1)、TNM分期(I-II=0,III-IV=1)、PRDX1 的蛋白表达(高=0,低=1)作为自变量纳入COX回归分析,统计过程中筛选变量的方式是Forward: LR法,COX单因素分析显示,肿瘤分化程度(OS:P=0.001,DFS:P=0.003)、浸润深度(OS:P=0.021,DFS:P=0.030)、淋巴结转移(OS:P= 0.006,DFS:P=0.001)、TNM分期(OS:P<0.001,DFS:P<0.001)及PRDX1的蛋白表达(OS:P=0.014,DFS:P=0.006)与胃癌患者的总生存时间和无病生存时间相关;COX多因素分析显示,PRDX1的蛋白高表达(OS:P<0.001,DFS:P=0.017)、TNM分期(OS:P<0.001,DFS:P=0.004)为胃癌患者总生存时间和无病生存时间的独立预后影响因子。见表2、3。
表2 COX单因素和多因素分析患者临床病理参数与总生存时间的相关性
表3 Cox单因素和多因素分析患者临床病理参数与无病生存时间的相关性
筛选胃癌诊断的分子标志物并能明确其在肿瘤发生发展中的作用乃至机制是极其重要的。因此,本课题组希望能寻找到胃癌的早期诊断标志物,并能对预后判断有一定的指导意义。
PRDX1是以抗氧化酶的作用被发现的,其对氧化应激非常敏感,在应激条件下可从过氧化物酶转化为分子伴侣[10]。最近有研究[11]表明,PRDX1的表达与人类肿瘤的发生发展密切相关。PRDX1基因位于1q34.1染色体上,而1q染色体的杂合性缺失已经被证实参与肿瘤的进展[12-13]。除了抗氧化物酶和分子伴侣功能,PRDX1还可增强自然杀伤细胞的细胞毒性,并抑制致癌蛋白,如c-Myc和c-Abl等的表达。PRDX1还可以通过结合磷酸酶及张力蛋白同源物基因( phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)促进PTEN的肿瘤抑制作用,并保护其脂质磷酸酶活性免受H2O2诱导失活[14]。实验[15]证明,缺乏PRDX1的小鼠会出现严重的溶血性贫血和各种类型的恶性肿瘤,这表明PRDX1可作为肿瘤抑制因子发挥作用。但迄今为止,PRDX1在胃癌中的表达及作用尚未被报道。
本研究了解到PRDX1在胃癌组织中的蛋白表达水平明显高于癌旁组织,且表达评分与患者的临床病理特征具有明显的相关性,PRDX1蛋白高表达患者胃癌细胞分化程度越低且病期越晚,淋巴结转移发生率越高。此外,生存分析显示:PRDX1蛋白高表达患者的总生存时间及无病生存时间均显著低于PRDX1蛋白低表达的患者。有研究[16]证明,PRDX1在大多数的肿瘤中高表达,并且PRDX1蛋白水平的高表达通常伴随着较差的预后。有学者[17]报道,PRDX1在少突神经胶质瘤中高甲基化,敲除PRDX1可显著促进细胞凋亡,降低Hs683胶质瘤细胞受到放疗或使用替莫唑胺化疗的存活率。PRDX1还可以通过刺激丝裂原活化蛋白激酶5(mitogen-activated protein kinase-5,MKP-5)活性来避免活性氧(reactive oxygen species,ROS)诱导的乳腺癌细胞的衰老[18]。Jiang等[19]报道,肺癌患者肿瘤组织中PRDX1的表达水平高,并且PRDX1的高表达可能与肺癌患者的淋巴结转移和肿瘤分化程度有关,且在肺癌发生发展过程中,血浆中PRDX1水平通常也较高,认为可以将PRDX1作为肺癌的生物学标志物。
综上,笔者推测PRDX1可作为胃癌诊断和预后的特异性标志物。但就目前来看,PRDX1在胃癌中的病理生理作用尚未被揭示,接下来拟进一步研究PRDX1在胃癌发生发展中的具体分子机制。