丁香油在鳊模拟保活运输中的效果

丁亚涛 杨 丰 王林林 施文正, 汪之和, ,

(1. 上海海洋大学食品学院, 上海 201306; 2. 国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海), 上海 201306;3. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306)

中国渔业资源丰富, 品种繁多。2017年, 中国全年水产品总产量6.45×1010kg, 同比增长1.03%[1];由此可以看出我国未来几年水产总量有着持续稳步的增长趋势。由于中国地域辽阔, 水产养殖量大,为了满足广大消费者对不同地区鲜活水产品的需求, 水产品保活运输显得十分重要。

一种有效的高密度鱼类运输方法可有效地减少应激反应和长途运输中的死亡率, 麻醉是一种有效的保活运输方法, 它通常能够降低代谢率[2,3], 提高运输效率和减缓应激反应[4]。一般常用的麻醉剂包括间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)、丁香油(4-甲-2-甲氧基苯酚)、醇类、氯醛、乙醚、氯酮、巴比妥酸盐、苯甲卡因和喹啉等。理想的麻醉剂应该具有无毒、廉价、快速诱导等特点[5]。目前, MS-222被美国食品和药物管理局(FDA)认为是可用的麻醉剂, 但是美国食品药品管理局要求使用MS-222处理的鱼必须经过21d的休药期; 丁香油被FDA认为是安全麻醉剂[6,7], 并对大西洋鲑(Salmo salar)[8]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[9]、鳜(Sini-perca chuatsi)[10]和西伯利亚鲟(Acipenser baerii)[11]幼鱼等鱼类的麻醉功效进行了研究。

鳊鱼又名鳊(Parabramis pekinensis)。在中国,鳊也为团头鲂(武昌鱼)和三角鲂统称。鳊是中国养殖量比较大且具有养殖潜力的淡水物种之一, 不仅味道鲜美, 且营养价值较高, 富含优质蛋白质。然而, 关于鳊麻醉保活运输的报道还没有。本研究为探索和确定丁香油在鳊麻醉保活运输中的最佳条件, 并在此条件下进行模拟运输, 分析鱼体指标变化, 为鳊的麻醉保活运输提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验准备

鳊源于中国上海的鱼市场, 体重(495.14±28.90) g,体长(20.37±3.06) cm。禁食暂养24h, 溶解氧＞ 6 mg/L。丁香油购买于上海安谱实验科技股份有限公司; 丁香油与乙醇按比例1∶9溶解, 配成浓度1 g/L备用。

1.2 主要仪器

5B-3N便携式氨氮测定仪(上海连华科技有限公司)、ZC-10智能型超级恒温水槽(宁波天恒仪器厂)、UV-1800PC紫外可见分管光度计(上海美谱达仪器有限公司)、JPB-607型便携式溶解氧测定仪(上海精密科学仪器有限公司)、车载速冻冰箱(佛山艾凯电器有限公司)。

1.3 实验方法

不同丁香油浓度下鳊呼吸频率影响的测定将丁香油配制0、5、10、20、30和40 mg/L 6个浓度梯度, 将鳊放入溶液开始计时, 分别记录鳊在60s、120s、180s、240s、300s和360s时间段内的呼吸次数。呼吸频率以1min内鳊鳃盖张合次数来表达(每个平行组样本为4尾鱼)。

不同浓度的丁香油对鳊麻醉效果的研究将鳊分别放入不同浓度丁香油麻醉液之中, 观察其行为特征和生理反应(每个平行组样本为4尾鱼)。当鳊被麻醉到A6阶段后, 立即将其转移入清水箱中复苏。确定麻醉和苏复时间及呼吸频率。表 1和表 2为鳊麻醉和复苏效果的标准及行为特征, 在麻醉过程中有6个阶段(A1—A6), 恢复过程分为3个阶段(R1—R3)。

不同浓度丁香油对鳊保活存活率的影响选择呼吸频率一致的鳊作为试验对象, 在0、10、20、30和40 mg/L这五个梯度进行试验, 记录鳊的存活率(每个平行组样本为10尾鱼, 下同)。

不同水温对鳊保活存活率的影响在20 mg/L麻醉剂浓度条件下, 选择2、7、15和20℃这四个温度梯度进行试验, 记录鳊的存活率。

表 1 麻醉程度分期及鱼类行为特征Tab. 1 Anesthesia effects and fish behavior characteristics

表 2 鱼体复苏过程分期及行为特征Tab. 2 Stages and characteristic behavior during fish recovery

不同鱼水质量比对鳊保活时间的影响在7℃和20 mg/L麻醉剂浓度条件下, 选择不同鱼水质量比(2∶1、1∶1、1∶3和1∶5)进行试验, 记录鳊保活时间。

保活条件的优化在丁香油麻醉液浓度(0、10、20、30 和40 mg/L)、水温(2、7、15、20℃)和鱼水质量比(2∶1、 1∶1、1∶3、 1∶5)单因素试验基础上, 确定鱼水质量比、水温和麻醉浓度三因素3水平正交试验来优化鳊的存活时间。表 3为正交测试L9(34)参数。

表 3 L9(34)正交试验因素及水平表Tab. 3 The table of factors and level in L9(34) orthogonal test levels

鳊保活过程中水体指标的测定在最佳条件下进行保活试验, 并测定水体相关指标。在保活过程中的不同时间段, 用离心管分别从保活箱中取25 mL水, 用PB-607A便携式溶解氧测定仪测定氧含量, 用5B-3N便携式氨氮测定仪测定氨氮, 用pH计测定pH。

菌落总数的测定: 在保活过程中的不同时间段, 用离心管从保活箱中取5 mL水, 使用国标GB 4789.2—2016进行测定。

鳊保活过程中鱼体指标的测定麻醉组和对照组分别在最佳条件下进行保活试验, 在保活过程中的不同时间段随机采样, 进行指标测定。

肌肉中乳酸和糖元的测定: 采用测试盒测定(购自南京建成生物工程研究所)。

肌肉pH测定方法: 准确称量2 g鱼肉于烧杯中,加0.85%生理盐水18 mL, 均质后静置0.5h, 使用pH计测定。

血清生化指标的测定: 从鱼尾静脉采血, 血清中谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、尿素(UARBAMIDE)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酐(CREA)采用试剂盒测定, 购自南京建成生物工程研究所。

数据处理使用Microsoft Excel 2007和SPSS19.0软件进行分析, 在单因素方差分析的基础上采用Duncan (D)多重比较法, 统计值为平均值±标准差, 显著性水平为P＜0.05; 利用Origin 8.0软件绘制相关图表。

2 结果

2.1 在不同丁香油浓度中鳊呼吸频率的变化

呼吸频率是反映鳊麻醉程度的重要指标之一。表 4中显示不同浓度丁香油麻醉液中鳊呼吸频率(鳃盖运动)的变化。随着丁香油浓度的增加, 呼吸频率逐渐下降。在0和5 mg/L浓度时, 鳊呼吸频率没有显著变化。在10 mg/L浓度下, 呼吸频率有所减少, 但二者均无应激反应, 在20和30 mg/L时,呼吸频率显著下降, 在40 mg/L时, 呼吸率在短时间内急剧下降, 出现鳃盖运动停止的现象。

2.2 不同麻醉浓度下鳊麻醉、复苏过程的行为特征及麻醉后复苏率

在不同浓度的丁香油麻醉溶液中, 鳊表现出一系列不同的行为特征(表 5和表 6)。麻醉和复苏时间随着丁香油浓度的不同而变化。随着丁香油浓度的增加, 鳊进入麻醉的时间缩短, 复苏时间也相应增加。丁香油浓度为0, 鳊没有被麻醉。在5 mg/L的浓度下, 鳊最终达到了A1阶段。在浓度增加到10 mg/L时, 鱼的麻醉程度加深, 最终将停留在A2阶段。在20 mg/L的浓度下, 需要较长时间达到A6, 复苏时间增加, 在清水中可以恢复到正常状态。当麻醉溶液浓度为30和40 mg/L时, 大多数鱼都达到了A6, 鱼体苏醒需要很长时间, 复苏后活力较差, 复苏率也有下降。

2.3 不同麻醉剂浓度对鳊存活率的影响

如图 1所示, 在浓度为0和10 mg/L时, 保活36h后存活率显著下降。麻醉浓度为20 mg/L, 保活48h内的存活率仍为90%; 麻醉浓度为30 mg/L, 存活率在24h后显著降低, 保活48h存活率下降至20%。当麻醉浓度40 mg/L, 12h后存活率显著下降,并且保活36h存活率降为0。由此可见, 麻醉浓度为20 mg/L保活时存活率较高。

2.4 不同温度对鳊存活率的影响

如图 2所示, 在水温20℃时的鳊的存活率显著下降, 在24h内下降到30%, 并且48h后存活率为0。在15℃时, 24h之后显著下降, 48h的存活率下降到30%。在7℃时, 36h后出现死亡, 48h的存活率为80%。然而在2℃时, 12h存活率下降到50%,24h存活率为0。由此可见, 在7℃保活时存活率较高。

表 4 鳊在不同浓度中各个时间段呼吸频率的变化Tab. 4 Breath frequency of bream at different times under of anesthesia of different concentrations

表 5 不同浓度丁香油对鳊麻醉影响Tab. 5 The effect of different concentrations of clove oil on the anesthetic level in bream

2.5 不同鱼水质量比对鳊保活时间的影响

如图 3所示, 当鱼水质量比从2∶1增加到1∶3时,存活时间显著增加, 且1∶1到1∶3保活时间增加了28h, 增幅较大。从1∶3到1∶5的增长并不显著, 所以鱼水质量比1:3比较适宜。

2.6 正交试验优化结果

单因素试验结果表明, 当丁香油浓度为20 mg/L时, 鳊存活率较高, 因此, 在正交试验中选择丁香油浓度为15、20和25 mg/L。水温在7℃和15℃时,鳊存活率较高, 所以, 在正交试验中选择了水温是5℃、9℃和13℃。鱼水质量比从1∶1增加到1∶3, 鳊存活时间增幅最大, 即正交试验中鱼水质量比选择1∶1、1∶2和1∶3。由表 3正交试验因素及水平进行试验, 得出正交试验结果见表 7。

表 6 鳊在不同丁香油浓度后的复苏情况Tab. 6 The effect of different concentrations of clove oil on the degree of the degree of bream

图 1 不同浓度丁香油对鳊保活的存活率影响Fig. 1 The variation in the survival rate of bream soaked in different concentrations of clove oil solution

正交试验结果显示(表 8), 影响鳊保活的因素为: A(鱼水质量比)＞B(水温)＞C(麻醉浓度), 麻醉保活最佳条件为A3B2C1, 即鱼水质量比为1∶3, 水温为9℃, 麻醉浓度为15 mg/L。

验证试验显示, 在此条件下, 鳊50h内存活率100%, 当保活64h, 存活率80%以上。而对照实验保活64h, 存活率仅为53.3%。

图 2 不同水温对鳊存活率的影响Fig. 2 Effect of different temperatures on the survival rate of bream

图 3 鱼水质量比对鳊保活时间的影响Fig. 3 The effect of the fish water quality ratio on the survival time of bream

2.7 鳊保活过程中水体指标的变化

如表 9所示, 在鱼水质量比为1∶3, 水温为9℃,麻醉浓度为15 mg/L条件下, 鳊保活运输过程中水质指标的变化。结果显示, 对照组和麻醉组水体pH在7.4—7.9; 溶解氧的含量在6.3—6.6 mg/L波动,无明显变化; 水中氨氮的含量显著上升, 麻醉组保活48h氨氮浓度上升至4.03 mg/L, 但明显低于对照组。菌落总数也有显著增加, 麻醉组略低于对照组。氨氮浓度和微生物这二项指标的增加可能是导致鱼体死亡的主要原因。

2.8 鳊保活过程中鱼体相关成分的变化

肌肉相关成分的变化如图 4所示, 在鱼水质量比为1∶3, 水温为9℃, 麻醉浓度为15 mg/L条件下, 鳊保活运输过程中鱼体肌肉指标的变化。结果表明, 在保活过程中, 鳊肌肉中糖元、乳酸和pH都发生了一定程度的变化, 糖元含量明显下降, 麻醉组保活48h后下降了35.5%, 下降趋势低于对照组。麻醉组乳酸含量在24h内显著增加, 增加趋势低于对照组, 然后略有下降。麻醉组和对照组pH均先降后升, 这与鳊在麻醉保活中肌糖元消耗产生乳酸导致pH变化有关。

血清生化指标的变化如表 10所示, 在鱼水质量比为1∶3, 水温为9℃, 麻醉浓度为15 mg/L条件下, 鳊保活运输过程中鱼体血清生化指标的变化。结果表明, 麻醉组谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)活性在12h后显著增加, 48h后AST和LDH的活性比初始值分别增加了4.3倍和1.9倍。血糖(GLU)含量逐渐增加。尿素和肌酐含量随保活时间的增加而上升, 48h后分别增加了2.9倍和3.5倍, 以上指标的变化均为麻醉组低于对照组。

表 7 正交试验结果Tab. 7 Results of the L9(34) orthogonal test

表 8 正交试验结果方差分析Tab. 8 Analysis of variance

3 讨论

3.1 丁香油浓度、水温和鱼水质量比对鳊存活率的影响

麻醉可以减少鱼类运输过程中的一般活动和应激反应。研究结果表明, 丁香油浓度对鳊保活运输的成活率有明显影响。随着丁香油浓度的增加,鳊的呼吸频率逐渐下降, 在丁香油浓度为20 mg/L时, 鳊的存活率最高。丁香油浓度40 mg/L时, 由于浓度过高, 会对鳊产生毒害而无法复苏, 降低了其存活率。而浓度为0和10 mg/L时, 由于浓度过低达不到麻醉鳊的效果, 对其存活率的提高作用较小。温度是影响鱼类生理状况的重要因素之一, 鱼类为变温动物, 其生理状况受环境温度的影响较大, 随着温度的升高, 鱼的代谢率增加, 耗氧量增加。但在过低温度下, 鱼体本身需要提供能量来应对外界低温, 呼吸频率下降, 无法满足鱼体用氧而导致其死亡, 鳊在在水温7℃左右运输存活率较高。在水产品保活运输中降低鱼水质量比是需要考虑的重点之一; 综合考虑保活时间和成活率等因素, 选择鱼水质量比1∶3符合最大的经济效益。

表 9 保活过程中水质指标变化Tab. 9 Changes in water quality parameters during the test

3.2 保活过程中水体指标变化对鳊存活率的影响

鱼类氨氮耐受水平一般在2.0 mg/L左右, 试验结果显示, 随着保活时间的延长, 氨氮浓度逐渐增加, 保活48h后对照组氨氮浓度是麻醉组的1.9倍, 说明麻醉能降低鱼体代谢产生氨氮, 减缓水质恶化, 更利于鳊的存活; 但麻醉组氨氮浓度也超出鱼类氨氮耐受水平, 这也是鳊保活48h后存活率下降的重要原因之一。这与Park等[4,12]研究尖吻鲈模拟麻醉运输和王利娟等[13]研究加州鲈保活的结果有类似的趋势一致。溶解氧对鱼类等水生生物的生存至关重要。当溶解氧低于5 mg/L时, 大多数鱼很难存活[14], 在试验过程中溶氧量范围在6.3—6.6 mg/L, 高于此推荐值。Rodrigues等[15]认为, 对于军曹鱼(Rachycentron canadum)来说pH安全值最低是6.5, 本试验中pH从6.9增加到7.8, 此结果在淡水鱼水质标准的pH 6.6—8.5[16]。菌落总数是评估水污染程度的重要指标[17]。在渔业水质标准中[16], 大肠杆菌的总数必须低于每5000个/L。随着水中细菌总数的增加, 氧气的消耗将会增加, 代谢废物增多, 从而导致水的浑浊度增加; 在鳊保活48h后, 细菌数增加, 水质发黄、浑浊, 这也是影响鳊存活时间原因之一。

图 4 保活过程肌肉中乳酸、糖元、pH的变化Fig. 4 Changes in lactic acid, glycogen, and pH in muscle during the experimental process

表 10 鳊保活过程中血清生化指标变化Tab. 10 Changes in the serum biochemical values in bream after transportation under anesthesia

3.3 麻醉保活对鳊肌肉相关成分和血清生化指标的影响

糖元、葡萄糖和乳酸水平在肌肉、血液和肝脏中保持一定的平衡, 鱼类利用肝糖元的能力差,主要分解肌糖元[18]。鳊在保活中肌糖元含量显著减少, 可能是因为鱼处于饥饿状态, 血液中葡萄糖无法满足鱼体的需要, 而肌肉糖元就会被分解, 这与王利娟等[19]研究加州鲈鱼模拟保活的结果类似。乳酸含量先升后降, 这与糖元分解产生乳酸有关, 并导致肌肉pH下降, 随着乳酸的分解, pH又上升。LDH是一种与葡萄糖代谢有关的酶, 当器官和组织受损时, LDH释放进入血液, 使血清LDH水平上升。AST是肝脏中连接糖、脂质和蛋白质代谢的一个重要酶, 当组织受损时会升高, 并且它能在谷氨酸和草酰乙酸之间起到催化转氨作用。在鳊保活中, 麻醉组血清LDH和AST在12h后显著增加,表明随着保活时间的延长, 对肝功能有一定程度的影响。血浆葡萄糖升高被认为是鱼类应激反应指标之一, 当细胞代谢功能失调, 葡萄糖利用率低时会导致血糖水平升高。在鳊保活试验中, 麻醉组血糖浓度在36h内增加了2.6倍, 之后血糖降低, 说明随着保活时间的延长, 鱼体会产生应激反应, 但鱼体通过自身的调节逐渐适应环境。尿素和肌酐含量的变化可以反映肾脏功能的代谢状况, 尿素也是维持血液渗透压的主要成分。在肾功能不全的情况下, 血液尿素和肌酐会增加。本实验结果显示, 麻醉组鳊血液尿素和肌酐含量逐步上升, 保活48h时分别增加了2.9倍和3.5倍, 说明在整个保活过程中肾功能受到一定程度的影响。综合以上指标可见,丁香油在用于鳊麻醉保活运输时, 有助于延长其保活时间和提高成活率。