伊洛河马口鱼遗传差异及其种群分化研究

邓 艳 王 雪 林鹏程 刘焕章 王绪祯

(1. 中国科学院水生生物研究所中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉 430072;2. 中国科学院大学, 北京 100049)

物种是生物进化的基本单元[1], 物种的识别和物种分化研究是生物多样性研究的重要领域。物种是由种群构成的, 种群的个体之间具有潜在的可交配的能力, 并且与其他物种的种群在繁殖上是隔离的, 物种在自然界中占据特定的生态位[2]。生态学研究认为, 具有完全相同的生态位的两个物种无法共存, 同域分布的物种通过占据不同的生态位实现共存[3—6]。传统的分类学采用形态特征来识别物种, 但是, 由于物种形态特征的趋同进化, 有些隐存种在从形态上难以识别[7,8]。于是, 分子分类研究开始尝试选择不同的分子标记, 利用一定的DNA序列差异作为标准以达到区分不同物种的目的[9—11]。

马口鱼(Opsariichthys bidensGünther)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae), 是东亚特有的一种小型鱼类, 在中国的各大水系的支流中均有分布, 多栖息于底质为砂石的小溪或江河支流中。杨干荣等[12]根据侧线鳞的数量将分布于中国的马口鱼分为黑龙江亚种和南方亚种。陈宜瑜[13]发现不同水系马口鱼的侧线鳞数目及数量呈现出自北向南递减的现象, 认为不能根据侧线鳞数目的变异去划出地域上的差异, 分布于东亚大陆的马口鱼应为一个种。形态学分析结果表明不同水系的马口鱼并没有形态上的差异, 只有侧线鳞数和背鳍前鳞数呈现自北向南递减的现象, 因此, 形态学研究趋向于认为中国大陆的马口鱼是一个处于分化中的种[14]。

近年来, 越来越多地研究者开始运用分子标记开展鱼类的隐存种研究[15—18]。与此同时, 马口鱼的分子生物学研究也取得了一些进展, 从而使鱼类研究者对马口鱼类的物种多样性及其隐存种现象有了新的认识。基于细胞色素b(Cytb)基因, Perdice等[19]对中国珠江、长江和海河水系的马口鱼的系统发育分析发现了五个谱系, 这些谱系间的遗传差异已经达到了种间水平, 可能为五个不同的种。针对Perdice五个谱系中的三个谱系, Johansson[20]用框架法进行了形态学的补充研究, 结果表明这三个谱系在形态上存在差异。Perdices[21]对长江和珠江马口鱼的分析结果表明, 这两个水系的马口鱼可能为三个种。李高岩等[22]基于Cytb基因序列分歧发现马口鱼以南岭为界分为两大谱系, 认为这两个谱系可能对应两个不同的种。

基于线粒体Cytb基因序列, 本研究对采自于伊洛河马口鱼遗传多样性进行分析, 构建的系统树呈现出两个支持率较高(100%)的分支, 分支间的遗传距离达到了3.1%。参照DNA条形码广泛采用的3%阈值的物种识别标准[9,11], 这两个分支可能代表不同的物种。因此, 本研究对伊洛河的马口鱼进行了进一步的微卫星和稳定同位素分析, 以检测这两个分支间是否发生了生殖隔离和营养生态位的分离。本研究的目的是为了明确伊洛河马口鱼两个分支的遗传差异是属于同一物种的分化还是不同物种的分化。

1 材料与方法

1.1 样品采集及总DNA的提取

在黄河支流伊洛河的4个地点(图 1), 我们共采集到48尾形态完整的马口鱼样品, 样品的鉴定参照鲤科鱼类志[12]。采集的样品利用95%的酒精保存,用于后续DNA的提取及稳定同位素的分析。DNA提取采用标准的高盐法[23]。利用1%的琼脂糖电泳检测提取的DNA质量。

1.2 细胞色素b基因序列扩增及数据分析

Cytb基因的PCR扩增体系总体积为30 μL, 包括双蒸水20.25 μL, 10×PCR 缓冲液 (含 MgCl2) 3.0 μL,正反向引物各1 μL (10 mmol/L), dNTPs (2.5 mmol/L each) 1.5 μL,Taq酶(2.5 U/mL, TaKaRa Bio) 0.25 μL,DNA模板3 μL。PCR扩增条件为94℃预变性5min,94℃ 变性30s, 53℃退火30s, 72℃ 延伸70s, 扩增30个循环, 72℃终延伸5min。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 纯化后的PCR产物用于测序。扩增引物使用通用引物(L14724: 5′-GACTTG AAAAACCACCGTTG-3′, H15915:5′-CTCCG ATCTCCGGATTACAAGAC-3′)以及根据马口鱼线粒体基因组设计的特定引物(F3: 5′-CGGA TTTTAACCGAGACCA-3′, R3: 5′-TCGGAT TACAAGACCGATG-3′)。

用SeqMan (DNASTAR Inc.)查看测序峰图, 对序列进行手工校正。利用MEGA7.0[24]进行遗传距离的计算与邻接树(Neighbor-Joining, NJ)构建, 采用P-distance模型, 进行了1000次自展分析验证树的节点的可靠性。贝叶斯分析利用MrBayes v.3.1.2[25]软件进行, 马尔可夫链的蒙特卡罗方法设置为4条马尔可夫链, 包括3条热链和1条冷链; 计算代数为2×107代, 每1000代对系统树进行抽样, 舍弃前面的5000棵树(25%), 剩余的树的用来产生一棵一致树。用DnaSP5[26]进行单倍型分析。

图 1 样品采集地点Fig. 1 Sampling sites and population names of O. bidens from the Yiluo River

1.3 微卫星(SSR)多态性分析

根据宽鳍鱲(Zacco platypus)的微卫星引物(引物未发表), 筛选能够特异性扩增且具有多态性的微卫星引物。SSR扩增体系总体积为20 μL, 包括双蒸水8 μL, 2×TaqMaster Mix (VaZyme) 10 μL,正反向引物各0.5 μL (10 mmol/L), DNA模板1 μL。PCR扩增条件为94℃预变性5min, 94℃ 变性30s,53℃退火30s, 72℃ 延伸1min, 扩增32个循环, 72℃终延伸5min。扩增产物用1%的琼脂糖电泳检测后送到商业公司检测扩增片段大小, 用GeneMarker软件对微卫星进行等位基因分型。用Excel对原始数据进行统计, 用Convert[27]进行数据格式转换, 转换后的数据用microchecker[28]检测是否有异常值及无效等位基因的存在。用Genepop[29]检测每个位点是否偏离哈温平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)以及位点间是否存在连锁不平衡(Linkage disequilibrium, LD)。用Arlequin3.0[30]检测两个分支间的遗传分化情况。群体固定系数Fst用来评估两个谱系的遗传分化程度[31]。基于基因型数据用Population1.2.32[32]计算两两个体间的遗传距离并构建NJ树(Bootstraps=1000)。

1.4 稳定同位素分析

我们将伊洛河马口鱼的两个分支分别定义为Clade A和Clade B, 共测定23个样品, 其中Clade A 14个样品, Clade B 9个样品。每个样品剪取适量的肌肉, 70℃烘干至恒重。用研钵研磨成均匀的粉末后密封保存。稳定同位素碳的含量在本实验室的DELTA VADVANTAGE (ThermoFisher Scientific)元素分析仪上测定, 仪器测量精度为±0.347‰(SD)。稳定同位素由δX表示,X的计算公式为X=1000[(Rsample/Rstandard-1)], 其中X代表13C 或15N,Rsample为13C/12C 或15N /14N的值。碳、氮稳定同位素的标准物质分别为 VPDB(美洲拟箭石)和 N2(氮气), 为保证原始数据的可靠性, 每隔5个样品放一个标样。稳定同位素碳和氮的量分别用δ13C和δ15N表示, 根据标准物质的测量值对原始数据进行校正后, 用SPSS检测δ13C 和δ15N在两个谱系间是否存在差异。分别以δ13C和δ15N为横纵坐标, 以包含δ13C-δ15N 二维空间的凸多边形总面积(TA, Total Area of convex hull)来表示种群或物种的营养生态位宽幅,以通过贝叶斯理论修正后的标准椭圆面积(SEAc,Standard Ellipse Area)来表示物种的核心生态位, 用R软件包中的SIAR及SIBER软件包分析马口鱼的两个分支的生态位的重叠情况[33,34]。

图 2 基于贝叶斯推论和邻接法构建的马口鱼的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of O. bidens using the Neighbor-joining Bayesian inference methods

2 结果

2.1 Cyt b基因序列变异

本研究成功获得48条Cytb基因DNA序列, 序列长度为1140 bp, 没有插入、缺失以及提前终止的情况。DNA序列的平均碱基组成分别为T=29.4%,C=29.8%, A=23.9%, G=16.9%。序列排列位点中包含了48个可变位点, 13个单倍型(数据未展示)。以海南马口(Opsariichthys hainanensis, KJ940933)和宽鳍鱲(Z. platypus, KF408383)为外类群, 构建的BI树和NJ树的拓扑结构一致, 伊洛河马口鱼聚为两个分支(图 2), 支持率为100%。马口鱼的两个分支间不存在共享单倍型(数据未展示), 两个分支均包含了来自于所有采样点的样本。伊洛河马口鱼分支间的遗传距离为3.1%, 分支内个体间的平均遗传距离为0.2%。

2.2 微卫星与遗传分化

在宽鳍鱲的微卫星引物中, 筛选到了11对能特异性扩增且具有多态性的引物(表 1)。根据NJ树把样品分为两个群体, 分别命名为Clade A(38个个体)及Clade B(10个个体)。两个群体间的11个微卫星位点均未检测到杂合子缺失和无效等位基因, 也不存在偏离哈温平衡的情况, 位点间不存在连锁不平衡。

通过微卫星标记检测两个群体是否发生了遗传分化。ANOVA分析结果显示, 只有0.12%的遗传差异来自两个群体间, 99.88%的遗传差异来自个体, 两个分支间并没有发生显著的遗传分化(Fst=0.0012,P=1)。为了更清楚地了解种群间个体的关系, 根据个体间的DAS距离构建个体间的关系树,得到的无根树分为两个支, 两个分支分别包含了34和14个个体(图 3), 黑色标记的个体来自由Cytb构建的系统发育树的Clade A, 红色标记的个体来自Clade B。

2.3 营养生态位

两个分支的稳定同位素碳(δ13C)和氮(δ15N)的测量数值见表 2, 稳定同位素碳(δ13C)和氮(δ15N)的量在两个谱系间均没有显著差异, 表明Clade A和Clade B在食物选择上没有差异。

表 1 微卫星扩增引物信息Tab. 1 SSR primers used in this experiment

图 3 由个体间的DAS距离构建个体间的关系树Fig. 3 The Neighbor-joining dendrogram of O. bidens constructed using the distance of DAS from 11 microsatellite loci

以包含δ13C-δ15N 的二维空间来表示物种的营养生态位宽幅(TA)和核心生态位(SEA), 结果显示,两个群体没有营养生态位的分离, Clade A和Clade B的TA分别为12.342、10.028, SEAc分别为5.041、6.429。Clade A和Clade B的SEAc的重叠面积为4.061, 分别占两个群体的核心生态位的80.3%和63.2%(图 4)。

表 2 稳定同位素的含量及两独立样本Mann-Whitney U 检验分析结果Tab. 2 Values of δ13C and δ15N and results of independent-samples Mann-Whitney U test

3 讨论

物种鉴定的分子标记通常要求物种间需呈现出较高的遗传差异, 但种内则为较低变异, 而且差异需要达到一定的标准[11,16]。基于Cytb基因序列,伊洛河流域马口鱼的两个分支的遗传差异可达3.1%。参考DNA条形码的标准, 伊洛河流域马口鱼两个分支之间的遗传差异达到了物种的水平。然而, 以微卫星为标记的种群遗传分析显示, 分支间的差异仅为总差异的0.12%, 而个体间的差异占了总差异的99.88%, 说明遗传差异主要来自个体间。Clade A和Clade B可能来自同一个祖先群体, 它们不存在种群遗传分化。利用微卫星标记计算的无根树也不能与Cytb的系统树相对应, 说明两个分支之间不存在繁殖隔离。同一物种的个体间存在较大的遗传差异, 其原因可能是祖先种群存在遗传差异[35—37]。

同域共存的不同物种之间应存在食物的竞争,它们通过利用不同的空间或采取不同的摄食策略占据不同的生态位[4,38,39]。稳定同位素可反映物种的食物来源和营养生态位, 碳值(δ13C)范围表示物种的食物来源的范围, 氮值(δ15N)范围表示物种的营养级位置[40—43]。本研究中, 以δ13C和δ15N表示的马口鱼的两个分支之间的营养生态位没有发生分离, 这可能是因为其栖息地及食物选择没有差异[22]。

综上所述, 基于Cytb基因伊洛河马口鱼的两个分支遗传分歧达到了种间水平, 但种群间不存在生殖隔离, 营养生态位也没有分离。这一结果并不符合隐存种的解释, 伊洛河两个分支间线粒体DNA的遗传差异可能源自于祖先种群的多态性[35—37]或者种间杂交[43—45]。此外, 中国马口鱼的物种多样性较为复杂, 形态学上并未发现显著差异[14], 其隐存种研究尚未取得一致的结果[13,20,46]。因此, 马口鱼隐存种问题的最终澄清还有待于研究者的进一步的系统深入研究。

图 4 马口鱼的两个分支的生态位宽幅(TA)及核心生态位(SEAc)Fig. 4 Trophic niche of O. bidens from the two clades