硫酸软骨素荧光传感器的构建新策略

马翾， 高思悦， 李可馨， 梁志宏， 姚志轶

中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种蛋白类黏性多聚糖，由N-乙酰半乳糖胺和特定位点硫酸化的葡萄糖醛酸的重复二糖单元组成，主要分布在动物组织中，平均分子量为20 kD[1-3]。目前根据提取来源(牛、猪、鲨鱼和鱿鱼软骨)分为陆地生物源性和海洋生物源性[4-6]。CS作为一种生物材料，存在于动物的骨骼、软骨、皮肤、基质和血管中，具有良好的生物相容性和生物降解性，目前多项研究报道了其抗炎活性、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗凝、抗血栓形成、神经调节和免疫原性不明显等生物学功能[7-12]。此外在临床应用中，由于硫酸化基团间紧密结合且带高电荷产生的静电排斥作用向软骨提供了大部分的抗压能力，因此已被用于治疗骨关节炎和其他软骨损伤疾病[13-14]。如Avachat和Kotwal等[15]对CS和双氯芬酸钠的口服控释片剂进行了开发，通过药物缓释用于治疗关节炎；此外Muzzarelli等[16]制备的CS复合海绵，协同粘性多糖透明质酸、壳聚糖有望用于伤口敷料。

鉴于CS优异的生物医学价值及保健品市场的监管需要，建立与发展CS的检测方法对于市售产品的品控监测具有重要意义。目前常见CS检测方法包括液相色谱法、光谱检测法、电化学分析法、竞争性酶联免疫法等[17-21]。这些检测方法在大型仪器的辅助下虽然精度高、线性范围广、效果稳定且重现性好，但也存在耗时费力、对操作人员要求高、不适宜大批量产品监测等问题。为此，我们希望开发一种可以用于快速可视化检测CS含量的简便方法。考虑到CS作为天然存在的阴离子粘多糖，分子链具有较高的负电荷密度，在水性介质中易与阳离子聚合物结合[22]，本研究希望借助聚电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵[poly(diallyldimethylammonium chloride),PDDA]及另一种具有高化学稳定性、长荧光寿命的负电荷芘类衍生物——8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐(8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt，HPTS)构建新型的CS传感策略[23-29]。其原理如图1所示，在水溶液中，PDDA可通过静电、π-π等作用诱导HPTS聚集而形成PDDA/HPTS复合物，导致荧光淬灭；当CS存在时，由于CS与PDDA之间更强的多重静电作用，促进PDDA/HPTS复合物的解体，从而使HPTS重新分散，实现HPTS荧光的恢复。

图1 CS传感器构建机理示意图Fig.1 A schematic diagram for CS sensor construction mechanism

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

硫酸软骨素(CS，北京百灵威科技有限公司)；HPTS(北京华威锐科有限公司)；三磷酸腺苷(ATP)、透明质酸(hyaluronic acid，HA)、葡萄糖(glucose)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、色氨酸(L-tryptophan，L-Trip)、谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)、甘氨酸(glycine，Gly)、糊精(dextrin)均购于上海麦克林生化科技有限公司；1 mmol·L-1磷酸缓冲液(phosphate buffer，PB，pH 7.5)中磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)分别购于两陇科技股份有限公司、北京化工厂。PDDA、磷酸钠(Na3PO4)均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；汤臣倍健氨糖软骨素片(软骨素含量0.102 g·片-1)。未标明纯度的化学试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

Mili-Q 超纯水系统(美国 Milipore 公司)；FA1 004分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；D3 024台式离心机(美国 Scilogex 公司)；微量移液器(德国 Eppendorf 公司)；超声波清洗机(北京天林恒泰科技有限公司)；手提式紫外分析仪(上海邦西仪器科技有限公司)；荧光光谱仪(安捷伦科技有限公司)。

1.2 样品的配制

称取一定量的HPTS，以超纯水溶解，初始浓度为5 mmol·L-1。称取一定量的PDDA用超纯水配制成浓度为10 mmol·L-1的溶液。保存在4 ℃冰箱中备用。

1.3 线性响应范围的验证

以PB缓冲液(1 mmol·L-1，pH 7.5)为溶剂，配制HPTS/PDDA混合溶液，使其中HPTS浓度为1 μmol·L-1，PDDA浓度为 5 μmol·L-1，并对其发射光谱进行测定[25]；之后逐渐加入不同浓度的CS，充分混合后测定相应的荧光光谱，直至混合溶液的光谱响应基本保持不变时停止加样。测定该体系对CS定量检测的线性情况，得到线性方程，并计算R2值。发射光谱激发波长为365 nm。

1.4 选择性及干扰性测试

选取9种常见产品中的干扰物：HA、ATP、Glucose、Gly、L-Glu、L-Trp、Na3PO4、BSA、Dextrin，按照与CS相同的测量方式，对探针的响应进行测定。发射光谱激发波长为365 nm。

类似地，在上述探针溶液中加入1 μmol·L-1的CS后，分别加入相同浓度的干扰物，混合均匀后测定荧光光谱响应。发射光谱激发波长为365 nm。

1.5 实际样品处理及加标回收测试

称取一定质量的氨糖软骨素片，粉碎后在10 mL水溶液中超声溶解30 min，离心后取上清液备用。进行10倍稀释后取1 μL上述样品溶液，加入HPTS/PDDA探针溶液中(1 mmol·L-1，PB缓冲液)，充分混匀后测定荧光光谱强度；随后，加入1 μL不同浓度的CS标准样，充分混匀后测其相应光谱，计算样品加标回收率。

2 结果与分析

2.1 HPTS/PDDA反应体系的筛选

为了使探针体系达到最优的检测效果，首先对HPTS及PDDA的比例及pH进行了筛选。由图2可知，HPTS在一定缓冲条件中表现出较强的荧光发射，最大发射波长位于510 nm[25];随着不同浓度PDDA的加入，HPTS荧光强度逐渐下降，并于PDDA浓度升至5 μmol·L-1时达到最低，其原因可能是PDDA诱导HPTS发生了聚集(图2A)。因此，选择HPTS∶PDDA=1∶5比例进行后续实验。此外，也对检测体系的pH进行了考察，由图2B表明，在pH 7.5条件下，二者结合后HPTS荧光淬灭最为有效，因此选择pH 7.5进行后续实验。

A：不同HPTS与PDDA比例的缓冲体系的荧光淬灭值；B：在1 mmol·L-1 PB缓冲溶液中不同pH下的荧光淬灭值。

2.2 CS的定量检测

在上述条件下，研究了HPTS/PDDA传感体系的荧光光谱随CS浓度变化情况。如图3A所示，在CS浓度为0 μmol·L-1时，HPTS/PDDA在510 nm处荧光发射峰较弱；随着CS的加入，溶液中510 nm处的荧光强度逐渐增强，其原因可能是CS与PDDA的多重静电作用而导致的HPTS/PDDA复合物的解体。当CS浓度达5.0 μmol·L-1时，荧光强度可增强至原来的10倍。同时，510 nm处荧光增强比(I/I0)与CS浓度之间呈现良好的线性关系(R2=0.998 2，浓度在0～5.0 μmol·L-1之间)(图3B)。该结果表明，HPTS/PDDA传感体系可用于CS的定量检测。根据IUPAC规定方法计算该方法的检出限(LOD)为2.8 μmol·L-1。研究发现，HPTS/PDDA传感体系荧光强度的变化还可以用肉眼进行观测，在365 nm手持式紫外灯的照射下， HPTS/PDDA溶液的绿色荧光随着CS的加入逐渐增强，表明HPTS/PDDA可用于CS的可视化检测(图3A)。

2.3 探针的特异性和干扰能力

A：HPTS/PDDA对不同浓度CS的线性荧光光谱响应，λex=365 nm；B：HPTS/PDDA传感系统与不同浓度的CS在PB缓冲溶液中的相对荧光强度(I/I0)及CS浓度与I/I0的线性关系，HPTS浓度为1.0 μmol·L-1，PDDA浓度为5.0 μmol·L-1。

为了进一步验证该体系的传感性能，考察了HPTS/PDDA在PB缓冲液(1 mmol·L-1，pH 7.5)中对CS及其他干扰物的响应情况，包括ATP、HA、Glucose、Gly、L-Glu、Na3PO4、BSA、Dextrin等。实验结果表明，CS的加入可以导致HPTS/PDDA体系荧光大幅增强，而其他干扰物的存在几乎不影响HPTS/PDDA的荧光。图4 A给出了510 nm处荧光增强强度比(I/I0)，其中CS可引起荧光9倍的增强，其他干扰物存在时荧光响应不超过3倍，表明探针对CS的特异性检测有统计学意义(P<0.05)。同时，也对该体系的抗干扰能力进行了考察，主要对比了在其他干扰物存在时，CS加入前后所产生的荧光响应情况(图4B)，结果表明该传感器对于干扰物存在时CS的检测具有一定的抗干扰能力。

A：CS、其他阴离子和生物分子分别存在时PB缓冲液(pH 7.5)的相对强度， CS的浓度为2.0 μmol·L-1，BSA的浓度为2 μg·mL-1，其他干扰剂浓度为2.0 μmol·L-1。B：CS、其他阴离子和生物分子同时存在时PB缓冲液(pH 7.5)相对强度。

2.4 实际样品分析

基于上述结果，我们将HPTS/PDDA探针用于实际样品中硫酸软骨素含量的检测。实验选取市面常见的保健品氨糖软骨素片(汤臣倍健)为测试样品，经本文所建立的方法检测，得到结果为每片中CS含量为0.095 g，与标签含量(0.102 g·片-1)相比，准确度为93.1%；同时，也对该传感器进行了样品加标测试，在添加3、5、7 μmol·L-1的3个标准样后测得的加标回收率在104%～121%。这些结果与文献报道相比较，具有良好的特异性、一定的抗杂质干扰能力，同时也适宜低浓度CS检测。上述结果表明，该方法具有良好的准确度与回收率，在一定程度上可以用于实际样品的应用测试。

3 讨论

随着社会经济的发展与人民生活水平的提升，大众对于功能保健产品的需求量越来越大。然而市售保健品的质量参差不齐，保健品掺假问题也层出不穷，成为人们关注的热点。作为促进骨关节健康类保健产品的核心组分，CS的快速检测具有重要意义。

基于荧光探针的生物传感器具有结构可调、易于观测、操作简便、成本低廉等特点。本文首次利用芘基荧光探针HPTS在聚电解质PDDA诱导下形成的组装体构建了一种可视化检测硫酸软骨素的新型传感器。其原理主要是基于CS自身的高负电荷密度，易与阳离子聚合物产生多重静电作用，在水溶液中可与HPTS有效竞争，导致PDDA/HPTS复合物的解体。此传感器的检测限可达2.8 μmol·L-1，线性范围为0～5 μmol·L-1，实际样品测试中的加标回收率为104%～121%。与毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子信标荧光检测和酶法检测等[30-34]手段比较，该方法具有以下几点优势：①操作简易，不依赖于大型仪器；②响应迅速，几分钟内能直观筛查CS产品质量到微摩尔级，克服了酶促反应的时间问题，“也减少了有机试剂挥发对操作人员带来的毒性危害等，”便于基层检测培训；③体系简单环保，在常温下100%水体系中即可完成检测，避免了插入分子信标带来的荧光不稳定性及酶存在时对温度和湿度的控制要求；④PDDA/HPTS传感组分易于购买，避免了繁琐的探针合成，降低了大批量检测成本；⑤“Turn-on”响应方式可以有效降低背景的干扰。

尽管如此，该传感器性能仍有提升空间，后续工作主要可从以下两个方面入手：①对HPTS进行化学修饰，提高其聚集时荧光的淬灭效率，以实现降噪作用；②引入其他荧光分子，设计比率性传感器。总之，该传感器的构建为硫酸软骨素的快速检测提供了一种新的思路，可与传统方法进行互补。我们相信该策略不仅可以用于硫酸软骨素与六偏磷酸钠、透明质酸等掺假成分的区分，而且可为其他生物活性分子的快速检测提供参考，在食品质量与安全控制以及生物医药检测等方面发挥作用。