人脐带血间充质干细胞通过抑制MEK/ERK通路改善LPS诱导的AECⅡ凋亡机制的研究

刘坚 龙婷婷 李晨彦

[摘要] 目的 探讨人脐带血间充质干细胞（hUC-MSC）对脂多糖（LPS）诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）凋亡的影响，及MEK/ERK信号通路在其中的作用。 方法 采用LPS与A549细胞共培养建立AECⅡ凋亡模型;将凋亡模型按随机数字表法分成6组，分别与MSC条件培养基（MSC-CM）、MEK/ERK通路抑制剂（PD98059）及PBS体外共培养，分别为A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+LPS+PD98059，阴性对照组为A549+PBS、A549+MSC、A549+PD98059，48 h后采用流式细胞术检测A549细胞凋亡情况;对MEK/ERK通路及凋亡相关信号（BAX/BCL-2、FAS、caspase 3及caspase 8）进行qPCR检测，对A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC四组组进行Western blot检测。 结果 建立A549+LPS凋亡模型。A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059组与A549+LPS+PBS比较，凋亡率显著下降。A549+LPS+MSC及A549+LPS+PD98059的MEK、ERK、BAX/BCL-2、caspase 3及caspase 8 mRNA扩增倍数均显著低于A549+LPS+PBS（P < 0.05），而蛋白水平上FAS、BAX、cleaved Caspase 3、p-MEK、p-ERK、A549+LPS+MSC較A549+LPS+PBS明显降低（P < 0.05），而TNF-R1差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 hUC-MSCs可能通过旁分泌作用抑制MEK/ERK信号通路磷酸化，影响内源性线粒体及外源性FAS/FASL途径进而减轻LPS诱导的AECⅡ凋亡。

[关键词] 间充质干细胞;细胞外信号调节激酶;凋亡;肺泡Ⅱ型上皮细胞;脂多糖

[中图分类号] R563          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（c）-0013-06

[Abstract] Objective To discuss the effect of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells （hUC-MSC） on alveolar type Ⅱ epithelial cells （AEC Ⅱ） apoptosis induce by lipopolysaccharide （LPS）， and the role of MEK/ERK signaling pathway. Methods The AECⅡ apoptosis model was established by LPS co-cultured with A549 cells. The apoptosis model was randomly divided into 6 groups according to random number method， they were co-cultured with MSC conditioned medium （MSC-CM）， MEK/ERK pathway inhibitor （PD98059） and PBS， which were named A549+LPS+MSC， A549+LPS+PBS， A549+LPS+PD98059， and the negative control groups were A549+PBS， A549+MSC， A549+PD98059. Apoptosis of A549 cells was detected by Annexin V/PI staining flow cytometry 48 h later. MEK/ERK pathway and apoptosis-related signals （BAX/BCL-2， FAS， caspase 3 and caspase 8） were examined by qPCR. The groups of A549+LPS+MSC， A549+LPS+PBS， A549+PBS， and A549+MSC were selected for Western blot detecting. Results The apoptosis model was established by A549+LPS. Compared with A549+LPS+PBS， the apoptosis rate of A549+LPS+MSC and A549+LPS+PD98059 were decreased significantly （P < 0.05）. The mRNA expression levels of MEK， ERK， BAX/BCL-2， caspase 3 and caspase 8 in A549+LPS+MSC and A549+LPS+PD98059 were significantly lower than those in A549+LPS+PBS （P < 0.05）. The expression of FAS， BAX， cleaved Caspase 3， p-MEK， and p-ERK protein in the A549+LPS+MSC and A549+LPS+PD98059 were significantly lower than A549+LPS+PBS（P < 0.05）. There was no significant different in TNF-R1 among each group （P > 0.05）. Conclusion hUC-MSCs may inhibit the phosphorylation of MEK/ERK signaling pathway affecting mitochondria pathway and FAS/FASL pathway by paracrine action， thereby attenuating apoptosis of AECⅡ induced by LPS.

[Key words] Mesenchymal stem cells; Extracellular signal-regulated kinases; Apoptosis; Alveolar type Ⅱ epithelial cells; Lipopolysaccharide

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）常继发于脓毒症，死亡率高（30%～40%），发病机制复杂，尚缺乏有效的治疗措施[1-2]。脓毒症释放大量炎症因子，肺泡上皮细胞损伤甚至凋亡是ARDS的病理、生理基础[3-4]。ARDS中肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial type Ⅱ cell，AECⅡ）的凋亡是AEC死亡的主要机制之一[5]。细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）在细胞的分化、增殖及凋亡中起关键作用[6-7]，本课题组前期已在脓毒症所致ARDS动物模型中发现MEK/ERK途径的磷酸化影响着AECⅡ凋亡[8]。

因人脐带血来源间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）有着较高的分化潜能及多种生物学作用，可改善脓毒症引起的ARDS[9-12]。本课题组前期研究发现MSC能够改善脓毒症所致ARDS小鼠中AECⅡ凋亡。本研究選用人类肺泡细胞癌来源并且具有类似AECⅡ代谢特征和形态学特征的A549细胞[13]进行研究，有望从体外试验明确MSC对AECⅡ凋亡在信号通路上的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株：A549细胞株由中国科学院细胞库提供。仪器：流式细胞仪（FACSCalibur，BD）;荧光定量PCR仪（7300，ABI）。试剂：LPS（L8880，Solarbio）细胞培养基（RPMI 1640 Hyclone）;总RNA提取试剂Trizol Reagent（15596-026，Invitrogen Life Technologies）;第一链cDNA合成试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622，Thermo）;山羊抗兔cleaved Caspase3单克隆抗体（bs-1518，Abcam），凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（KGA08，凯基生物）;PCR引物（Invitrogen Biotechnology Co.，LTD）;cleaved-caspase8（10380-1-AP，PTG）;bcl-2（2870S，CST）;bax（1163，EPI）;TNF-R1（ab2143，Abcam）;p-MEK（ab96379，Abcam）;ERK（4371，bioworld）;p-ERK（4371，cst）;MEK（bs-1041R，BIOSS）;β-actin（sc-1616R，Santa）;Pro-caspase3（bs-1518，Bioworld）;FAS（sc-1023，Santa）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

hUC-MSCs为湘潭市中心医院生殖中心从人脐带血中分离取得，细胞标记及分化潜能在本课题组前期研究中已证实[14]。

1.2.2 建立A549凋亡模型

将对数生长期细胞消化后，按4000细胞/孔接种于96孔板，培养24 h贴壁。继续培养24 h后按随机数字法分为3组，对照组为正常培养的A549细胞;实验组细胞中分别加入不同浓度的 LPS（10、20 μg/mL）并刺激48 h，选择凋亡水平最高的LPS浓度，建立A549凋亡模型。

1.2.3 Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测A549细胞凋亡率

分别将A549细胞在对照组培养基和hUC-MSC条件培养基中培养48 h。将细胞消化，离心，去上清。加入1×结合缓冲液400 μL重悬细胞，加入5 μL Annexin-V-FITC混匀，室温避光15 min。加入10 μL PI混匀，冰浴避光5 min。1 h内Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测，PI红色荧光通过PI通道（FL2）检测。

1.2.4 检测MSC及MEK/ERK通路抑制剂（PD98059）对LPS诱导A549凋亡的影响

将对数生长期A549细胞用胰蛋白酶消化，按4000细胞/孔接种于96孔板，按随机数字表分成6组，每组16孔，实验组为A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059，对照组为A549+LPS+PBS，阴性对照组为A549+MSC、A549+PD98059、A549+PBS。48 h后Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测三组细胞凋亡的改变情况。

1.2.5 Rt-PCR及Western blot检测MEK/ERK通路相关基因及蛋白的表达

对6组细胞进行qPCR检测，取A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+MSC、A549+PBS行Western blot检测。

1.2.5.1 Rt-PCR定量检测  MEK及ERK、BAX、BCL-2、TNF-R1、FAS、caspase 3、caspase 8的mRNA水平  分别收集各组A549细胞，从细胞中分离总RNA，采用Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies），从各细胞样本中取总RNA 5 μg，反转录成cDNA。Rt-PCR筛选候选基因及采用β-actin作为内参。使用Primer Express 2.0软件设计各引物基因序列，β-actin上游引物为5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物为5′-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′，BAX上游引物为5′-GCCTTTTGCTACAGGGTTCAT-3′，下游引物为5′-TATTGCTGTCAGTTCATCTCCA-3′，BCL2上游引物为5′-TGACTCTCTCGTCGCTACCGT-3′，下游引物为5′-CCTGAAGAGTTCCTCCACACC-3′，CASP3上游引物为5′-GTCTGACTGGAAAGCCGAA-AC-3′，下游引物为5′-GACTGGATGAACCACGACCC-3′，FAS上游引物为5′-GAAGAGACCCCTGTGG-TATTTGA-3′，下游引物为5′-ACACTTTTCCGCTCACAATCAGA-3′。采用Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche）在荧光定量PCR仪（7300）完成操作。

1.2.5.2 Western blot检测  采用Western blot检测其中A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC四组细胞内FAS、BAX、BCL-2、TNF-R1、caspase 3、cleaved caspase 3、p-MEK、p-ERK表达水平。细胞总蛋白提取，使用RIPA裂解缓冲液提取蛋白质，并对蛋白质含量进行定量。将样品（30 μg等蛋白）进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。针对FAS、BAX、BCL-2、TNF-R1、caspase 3、cleaved caspase 3、p-MEK、p-ERK的一抗探测探针，随后与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔二抗（1∶2000）。采用兔单克隆抗β-actin作为上样对照。Quantity One软件分析各蛋白条带灰度值。以目标蛋白与内参β-actin灰度值比值代表各蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AECⅡ凋亡体外模型探索

Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测各组细胞凋亡结果，如图1所示，因随着LPS浓度继续增大，A549细胞以坏死为主[15]，故采用LPS（20 μg/mL）建立诱导A549凋亡模型。

2.2 hUC-MSC和PD98059干预后对LPS诱导的A549凋亡影响

与A549+LPS+PBS比较，A549+LPS+MSC及A549+LPS+PD98059的A549凋亡率显著下降（P < 0.05）。见图2。

2.3 MSC对MEK/ERK通路相关基因及蛋白的表达水平的影响

2.3.1 Rt-PCR定量检测MSC抑制MEK/ERK通路相关基因mRNA表达情况

A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059中A549细胞内BAX、CASPASE 3、CASPASE 8、MEK、ERK的mRNA扩增倍数水平低于A549+LPS+PBS，而BCL-2高于A549+LPS+PBS（P < 0.05）。A549+LPS+PD98059与A549+LPS+PBS的FAS mRNA扩增倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）。而A549+LPS+MSC、A549+LPS+PD98059TNF-R1 mRNA扩增倍数与A549+LPS+PBS组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.4 MSC对MEK/ERK通路及凋亡相关信号表达水平的影响

选择 A549+LPS+MSC、A549+LPS+PBS、A549+PBS、A549+MSC 进行Western blot检测，BAX及cleaved-caspase 3的蛋白水平，A549+LPS+MSC较A549+LPS+PBS下调（P < 0.05）。与A549+LPS+PBS比较，A549+LPS+MSC的p-MEK及p-ERK水平、p-MEK/t-MEK、p-ERK/t-ERK比值均降低（P < 0.05），而各组TNF-R1差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

本研究验证了hUC-MSCs可以改善LPS诱导的AECⅡ的凋亡水平，其通过旁分泌改变细胞微环境来抑制FAS/FASL系统及内源性线粒体凋亡途径的激活，而MEK/ERK信号在其中扮演重要角色。

MEK/ERK是Ras丝裂原信号转导下游的核心元件，在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，当细胞外刺激物（如LPS、细胞因子）与相应受体结合后，SOS与受体或受体底物上的酪氨酸（Tyr）磷酸化位点结合，在Ras附近形成高浓度的SOS，其促使GTP取代Ras上的GDP而活化Ras，使MEK催化区中Thr和Ser磷酸化激活MEK，发挥调控细胞凋亡的作用[16-17]。根据之前本课题组研究发现的脓毒症所致ARDS中AECⅡ凋亡的机制与MEK/ERK磷酸化相关[8]，结合此次体外研究结果，即在LPS诱导A549凋亡模型中，p-MEK/p-ERK蛋白表达增高，本研究认为可能是LPS激活Ras/MEK/ERK信号通路，促进MEK和ERK磷酸化，进而导致细胞色素C的大量释放，形成凋亡体后激活caspase 3，爆发级联反应，最终导致AECⅡ凋亡[18-19]。

MSC通过旁分泌各种生长因子，弥补损伤情况下生物多样性重要成分，发挥调节如NF-κB、PI3K/AKT等重要信号通路的活性，从而改善凋亡的作用[9，20]。本研究结果发现，通过MSC-CM及PD98059与LPS诱导A549共培养，A549凋亡情况均改善，同时MSC与PD98059一致，其Bax/Bcl-2、Fas及MEK、MRK在基因水平與对照组存在明显差异。且经MSC及PD98059干预后，Bax/bal-2的比例及caspase 3也较对照组明显下调。结合MSC干预组的BAX和FAS在蛋白水平的表达上显著低于对照组，且p-MEK和p-ERK的蛋白表达同样弱于对照组，充分说明MSC极有可能是通过抑制MEK/ERK信号通路的磷酸化，从而抑制AECⅡ的凋亡，但其上游相关信号（Raf/Ras）如何调控MEK/ERK的活化尚需进一步的验证。

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（收稿日期：2019-10-09  本文编辑：任   念）