白藜芦醇葡萄糖苷的生物合成

王书元，张雨彤，杨芳，于晓海，陈慧，金建明*

北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室（北京 100048）

白藜芦醇也称3, 4', 5-三羟基芪、虎杖苷元、茋三酚和芪三酚等，是一种多酚类化合物，具有顺、反2种结构。天然的白藜芦醇为反式结构（图1）。白藜芦醇主要存在于葡萄属、蓼属、花生属和藜芦属等植物中。白藜芦醇分子结构中存在3个酚羟基，在溶液中易被氧化。但白藜芦醇难溶于水。研究表明白藜芦醇有很好的生物活性，具有抗衰老、抗肿瘤、防治心血管疾病，以及抗菌、抗氧化和免疫调节等生物活性[1-5]。白藜芦醇被广泛应用于食品、保健品、化妆品等领域。

图1 白藜芦醇分子结构式

虽然白藜芦醇的生物活性在全球范围内得到认可，但白藜芦醇仍存在水溶性差和容易氧化等问题[6]。在研究白藜芦醇的生物合成时也发现其水溶性很差而且易氧化[7]。白藜芦醇的糖基化衍生物不仅有助于提高其水溶性和防止其氧化，也可提高其生物利用度[6]。但由于白藜芦醇的酚羟基比较活泼，糖基化反应很难通过化学合成进行，而且难以解决化学合成过程中糖基的手性问题。因此通过基因工程克隆表达葡萄糖基转移酶催化白藜芦醇合成其葡萄糖苷是最佳选择。在工程菌中克隆并改造葡萄糖基转移酶，提高其催化合成儿茶素、大豆苷元、金雀异黄酮和水飞蓟宾的葡萄糖苷的效率[8]。试验克隆一个淀粉蔗糖酶（AS），初步研究其催化白藜芦醇合成白藜芦醇葡萄糖苷的性质，为进一步改造该葡萄糖基转移酶高效合成白藜芦醇葡萄糖苷和研究白藜芦醇葡萄糖苷的生物活性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

中度嗜热菌Deinococcus geothermalis（中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心）；大肠杆菌Escherichia coli MC1061和BL21和质粒pET-28a（实验室保存）。

1.1.2 试剂耗材

Pyrobest DNA Polymerase和rTaq聚合酶（宝生物工程（大连）有限公司）；限制性内切酶NdeI和XhoI、T4 DNA连接酶（New England Biolabs公司）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒纯化试剂盒（Omega Bio-Tek公司）；BCA蛋白质定量试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）；蛋白质marker（Thermo Scientific公司）；异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl βd-thiogalactoside，IPTG，亚辰博奕科技（北京）有限公司）；葡聚糖凝胶（GE公司）；硅胶、硅胶板（青岛海洋化工厂）；甲醇、乙酸乙酯等化学试剂（均为分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建和转化[9]

培养中度嗜热菌D. geothermalis，提取基因组DNA。根据文献设计一对引物：pET-NdeI-GAS-F（5'-CATATGCTGAAAGACGTGCTCACT-3'）和pETXhoI-GAS-R（5'-CTCGAGTGCTGGAGCCTCCCCGGCGGT-3'）。以中度嗜热菌D. geothermalis基因组DNA为模板，pET-NdeI-GAS-F和pET-XhoI-GAS-R为PCR引物，用Pyrobest DNA Polymerase扩增得到基因dgas。PCR扩增条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，55 ℃1 min，72 ℃ 2 min，反复循环30次，72 ℃ 5 min。PCR产物经凝胶电泳检测观察到预期的DNA分子条带，并用PCR纯化试剂盒纯化目的基因dgas DNA。把纯化目的基因dgas DNA和空质粒pET-28a分别用NdeI和XhoI进行双酶切反应，酶切后的DNA经凝胶电泳和凝胶DNA回收试剂盒回收纯化。把2段回收的DNA按2︰1混合后加入T4 DNA连接酶，在16 ℃反应过夜。连接生成的质粒pET-DGAS通过电击转化法转入感受态大肠杆菌MC1061细胞。复苏后涂布于已加入卡拉霉素的LB平板中。37 ℃过夜培养后挑取8个单克隆菌落，用rTaq聚合酶进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测。产生预期DNA分子条带的单克隆菌落再分别接种于3 mL含卡拉霉素的LB培养液中，在37 ℃，以250 r/min振荡培养12 h以上。按照质粒提取试剂盒说明提取质粒并测序。测序正确的质粒pET-DGAS再经电转化转入大肠杆菌BL21中。在卡拉霉素抗性的LB平板中37 ℃培养过夜得到单克隆。

1.2.2 DGAS的诱导表达、纯化和鉴定[8]

从平板中挑取的单菌落及带有空质粒pET-28a的菌株，分别接种到灭菌的含卡拉霉素的LB培养液中。接种的培养液在温度37 ℃，转速250 r/min下培养7～8 h，测定菌液OD600nm值，OD600值为0.6～0.8时，加入IPTG，在30 ℃，以250 r/min诱导培养10～12 h。

诱导表达培养好的菌液在4 ℃，5 000×g离心5 min，弃上清，菌体沉淀用体积1/10的培养液1 mol/L磷酸钾缓冲液重悬，置于冰浴中间隔超声破碎细胞。超声条件为超声时间5 s，超声间隔时间5 s，超声时间3 min/mL。超声后的溶液在4 ℃，以17 000×g离心10 min。取上清即为粗酶液。

粗酶液经SDS-PAGE和酶活力检测确定后，用Ni-NTA柱纯化DGAS。根据粗酶液中DGAS的表达量选择Ni-NTA的量。粗酶液经Ni-NTA柱后，用10 mmol/L的咪唑洗脱，再用20 mmol/L的咪唑洗脱目标蛋白DGAS，小量分管收集，经考马斯亮蓝法测定蛋白浓度和DNS法测定DGAS酶活力。经SDS-PAGE检测纯化的DGAS及其纯度。

1.2.3 SDS-PAGE

SDS-PAGE所用的分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%。16 μL蛋白样品中加入4 μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后煮沸10 min，冷却后12 000×g离心10 min。取上清5 μ L上样。电泳条件为80 V电泳30 min，120 V电泳1 h。剥离取出的凝胶在考马斯亮蓝R250染色液中染色2 h，用脱色液中脱色，直到凝胶颜色完全脱去，观察到凝胶中清晰的蛋白条带。

1.2.4 DNS法测定DGAS酶活力[8]

将150 μ L酶液和150 μ L含0.2 mol/L蔗糖的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液混合，于37 ℃反应30 min，取出100 μL反应液再加入100 μL DNS试剂，混合均匀后沸水浴煮5 min。冷却后测定OD540nm值。

1.2.5 DGAS催化白藜芦醇产生糖基化产物反应[10]

催化反应在100 mmol/L磷酸钾缓冲液1 mL中进行。含25 mmol/L的白藜芦醇底物（DMSO溶解）和100 mmol/L的蔗糖，500 μL酶液或未导入质粒PET28a的粗酶液作为空白对照。反应温度为37 ℃，保温反应3，6，12和24 h后分别取样，于50 ℃加热2 h，使酶失活以终止反应。反应产物先用TLC显色检测确定，通过HPLC进一步检测分析白藜芦醇及其糖基化产物确定最佳反应时间为3 h。

1.2.6 白藜芦醇及其糖基化产物的HPLC检测分析[7]

HPLC运行在岛津LC-20AT液相色谱仪器；色谱柱为C18反相分析柱（公司Waters，型号Symmetry，介质颗粒大小5.0 μm，规格4.6 mm×250 mm）；柱温45℃；35%乙腈（0.1%甲酸），流速0.5 mL/min，检测波长305 nm。

1.2.7 白藜芦醇糖基化产物的分离纯化

大规模催化反应总体积为400 mL。其中，含20 mmol/L白藜芦醇底物（1.83 g，DMSO溶解）和100 mmol/L的蔗糖，以及200 mL酶液。在37 ℃保温反应3 h。再50 ℃加热2 h以终止反应。反应液在8 000 g下离心5 min，上清液用抽滤瓶进行抽滤。在50 ℃用旋转蒸发仪真空浓缩。硅胶拌样后进行硅胶柱层析，用含0.5%乙酸的乙酸乙酯-甲醇（20︰1，V/V）至甲醇进行梯度洗脱。收集白藜芦醇糖基化产物部分，浓缩后进行葡聚糖凝胶柱层析，用30%甲醇至100%甲醇梯度洗脱得到化合物1（256 mg）和2（89 mg）。

1.2.8 化合物1和2的NMR条件

纯化的2个白藜芦醇糖基化产物溶解在氘代甲醇（MeOD），以四甲基硅烷（TMS）作为内标，在Bruker Avance 400 MHz核磁共振波谱仪上分析得到1H，13C和2D NMR谱图。

1.2.9 化合物1的溶解度检测[8]

在室温条件下配置白藜芦醇和化合物1的过饱和水溶液，置于密封的1.5 mL离心管。在摇床中25 ℃，以250 r/min振荡24 h。离心管在25 ℃，17 000×g离心5 min。上清液经过0.22 μ m滤膜过滤。采用HPLC检测饱和水溶液中白藜芦醇和化合物1含量。

2 结果与分析

2.1 DGAS的表达

从中度嗜热菌D.geothermalis中通过PCR克隆的基因dgas经凝胶电泳检测符合预期的DNA大小（约2.0 kb）。纯化的该基因DNA经内切酶完全消化后连接后载体pET-28a，再转入转化效率高效的大肠杆菌MC1061。从卡拉霉素抗性平板上挑取8个单菌落经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测验证有6个单克隆扩增到预期的DNA条带。从这6个单克隆提取的质粒经测序证明都插入正确的基因dgas。插入正确基因dgas的质粒再转入大肠杆菌BL21，诱导表达后超声破细胞的粗酶液经DNS法检测确定克隆的DGAS具有催化水解蔗糖产生果糖的活性。在SDS-PAGE上，含插入基因dgas的质粒pET-DGAS的菌株的蛋白条带明显比含空质粒的菌株经诱导表达后多出一粗条带。同时，SDS-PAGE结果显示纯化的DGAS的分子量为73.0 kDa（图2），这与预期一致。表明克隆的基因dgas在大肠杆菌中成功表达。

图2 SDS-PAGE

2.2 DGAS催化白藜芦醇生成白藜芦醇糖基化产物

纯化的DGAS在磷酸钾缓冲液中催化白藜芦醇反应的TLC结果表明，在白藜芦醇的显色带下方出现其他与白藜芦醇显色相同的条带。采用HPLC检测也证明催化反应产生其他化合物。空质粒的菌株的酶液（图3A）经HPLC检测只出现白藜芦醇（峰3，保留时间11.8 min）。DGAS催化白藜芦醇的反应液的HPLC检测谱图显示，除了白藜芦醇（峰3）外，还出现2个化合物1（峰1，保留时间6.3 min）和2（峰2，保留时间5.5 min）（图3B）。另外，一定比例的DGAS粗酶液催化白藜芦醇和蔗糖反应，反应液经HPLC检测也表明催化反应生成这2个化合物1和2。催化反应3，6，12和24 h后，反应液的HPLC检测也都表明多了这2个化合物，而且化合物1和2的浓度变化不大。表明在催化反应3 h后催化反应几乎达到平衡。

通过大规模培养制备DGAS，并以蔗糖为葡萄糖基为供体，白藜芦醇为受体，进行大规模催化反应。反应液经硅胶柱层析先洗脱除去白藜芦醇，白藜芦醇糖基化产物经葡聚糖凝胶LH20柱层析得到2个化合物1和2。化合物1和2经HPLC检测分析确定为DGAS催化白藜芦醇反应产生的2个化合物（图3B、C和D）。

图3 HPLC检测分析白藜芦醇糖基化产物

2.3 化合物1和2的结构鉴定

化合物1的1H NMR谱图显示，其存在1个糖基端基碳的质子信号峰δ5.49。耦合常数J=2.8 Hz表明该糖基为α-构型。其13C NMR谱图也表明，除了白藜芦醇的碳信号峰，化合物1明显存在1个葡萄糖基的6个碳特征峰。结合2D NMR，归属化合物1的1H和13C的所有化学位移（表1）。在HMBC谱图上，葡萄糖基端基碳的质子信号峰δ5.49与碳信号δ158.3相关，表明葡萄糖基与苷元白藜芦醇的C4'位上的羟基相连接。因此，化合物1的结构鉴定为白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2的1H NMR谱图表明有2个糖基端基碳的质子信号峰δ5.50（d，J=1.9 Hz）和5.21（d，J=1.9 Hz）。耦合常数J=1.9 Hz表明这2个糖基都为α-构型。其13C NMR谱图也表明，除了白藜芦醇的碳信号峰，该化合物明显存在2个葡萄糖基的12个碳信号峰。结合2D NMR，归属了化合物2的1H和13C的所有化学位移（表1）。在HMBC谱图上，葡萄糖基端基碳的质子信号峰δ5.50与碳信号δ157.7相关，表明葡萄糖基与苷元白藜芦醇的C4'位的羟基相连接；另一个葡萄糖基端基碳的质子信号峰δ5.21与碳信号δ84.3相关，表明该葡萄糖基与内侧的葡萄糖基的C4为的羟基连接。因此，化合物2的结构鉴定为白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。

表1 化合物1和2的NMR数据

2.4 化合物1的溶解度

在25 ℃温度下，配置化合物1的过饱和溶液，经HPLC检测分析，化合物1的溶解度为2.26 mg/mL。在纯水中，白藜芦醇由于溶解度太低，经HPLC很难检测计算其溶解度。

3 讨论

白藜芦醇的生物活性具有广谱性，但由于其含有2个苯环结构，使得其在水溶液中溶解度比较低。而白藜芦醇糖基化产物将极大的提高其溶解度。淀粉蔗糖酶（AS）是葡萄糖基转移酶（Glycosyltransferase，E.C.2.4.1.4）的一种，属于糖苷水解酶（GH）13家族[11]。该类酶具有水解蔗糖的葡萄糖基并把水解下来的葡萄糖基转移到供体上的特性。来自中度嗜热菌D.geothermalis的淀粉蔗糖酶DGAS已经被证明能催化氢醌合成熊果苷[10]。因此，试验克隆中度嗜热菌D.geothermalis的DGAS研究其催化合成白藜芦醇葡萄糖苷的能力。从中度嗜热菌D.geothermalis克隆的DGAS能在大肠杆菌BL21诱导表达，经SDS-PAGE证明其分子量符合预期，并且经DNS法检测DGAS具有水解蔗糖活性。因此，确定成功克隆表达DGAS。

以蔗糖为葡萄糖基供体，白藜芦醇为受体，经HPLC检测分析DGAS能够催化生成2个白藜芦醇葡萄糖苷，但是转化效率并不是很高。由于白藜芦醇有3个酚羟基，因此需确定葡萄糖基连接在哪个酚羟基及葡萄糖苷键的构型。因此，通过大规模反应制备和纯化这2个白藜芦醇葡萄糖苷。由于反应液中白藜芦醇的含量比较高，用硅胶柱层析先洗脱除去白藜芦醇，把2个白藜芦醇葡萄糖苷洗脱下来。由于该2个化合物通过硅胶柱层析很难分离纯化而且在反相硅胶C18柱层析也很难分离纯化，而通过葡聚糖凝胶LH20柱层析容易纯化这2个化合物。通过NMR确定这2个白藜芦醇葡萄糖苷的葡萄糖基都为α-构型，符合DGAS的催化性质[11]。葡萄糖基只连接在白藜芦醇的4'位的羟基表明DGAS不能催化白藜芦醇的3位和5位的羟基糖基化，即DNAS能催化白藜芦醇对位的酚羟基，不能催化间位的酚羟基。因此，推断DGAS以蔗糖为葡萄糖基为供体，先转移1个葡萄糖基到白藜芦醇的4'位的羟基生成白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷，转移1个葡萄糖基到白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的糖基4位羟基上生成白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖苷（图4）。

比较研究白藜芦醇和白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的水溶性过程中，发现采用HPLC通过紫外吸收法难以检测白藜芦醇的溶解度。这可能是由于白藜芦醇在水中溶解度太低以致仪器难以检测到。白藜芦醇葡萄糖苷在水中的溶解度很容易通过HPLC检测得到。根据文献报道，白藜芦醇在水中的溶解度为0.03 mg/mL[6]。因此，与白藜芦醇在水中的溶解度相比较，白藜芦醇葡萄糖苷大幅度提高了其水溶性。

图4 DGAS催化白藜芦醇生成化合物1和2

4 结论

中度嗜热菌D. geothermalis的淀粉蔗糖酶DGAS能以蔗糖为葡萄糖基供体，催化白藜芦醇合成2个白藜芦醇葡萄糖苷，即白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。另外，产生的白藜芦醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的水溶性比白藜芦醇的大很多。