响应面法优化莜麦蛋白微波辅助碱法提取工艺

宁芯 ，班薇薇，王国泽，莫紫梅，汪磊 *

1. 玉林师范学院化学与食品科学学院（玉林 537000）；2. 广西农产资源化学与生物技术重点实验室（玉林 537000）；3. 内蒙古科技大学生命科学与技术学院（包头 014010）；4. 广西-东盟食品药品安全检验检测中心（南宁 530001）

莜麦又称裸燕麦，起源于我国，在我国高寒地区粮食生产中占有重要的地位[1]。莜麦是世界公认营养价值很高的粮种之一[2-3]，颇具保健疗效[4-6]。随着人们生活水平的提高和对营养概念的不断认识，莜麦制品正日益受到人们的青睐，已被广泛应用于食品、饲料、医药、化妆品和工业原料等领域[7-9]。莜麦中蛋白质高达11.4%～19.9%，居禾谷类作物之首[1,10-11]。莜麦蛋白质是谷物中氨基酸组成最平衡的蛋白质之一，其氨基酸含量多且种类齐全，配比合理，人体利用率高，其中人体的8种必需氨基酸是小麦的2倍多，且含有较多儿童发育不可缺少的组氨酸和赖氨酸[12]。经常摄入莜麦食品，可以有效改善我国传统膳食引起的赖氨酸缺乏症。因此，莜麦蛋白是优质的蛋白质资源，具有良好的开发前景。

传统的蛋白质提取主要采用碱法提取，该方法虽然比较成熟，但需耗费大量碱液，所得的蛋白质纯度不高，且提取率低，提取时间长，易造成蛋白质的水解和结构破坏[13-14]。微波辐射辅助提取法利用微波强化固液浸取过程，具有选择性高、提取时间短、提取得率高以及不需要特殊的分离步骤等优点，是一种颇具发展潜力的提取技术[15]，近年来微波辅助提取法已被广泛应用于多糖[16]、多酚[17]和蛋白[18-19]等成分的提取。

当前，常规碱法提取莜麦蛋白的研究较少，且采用微波辅助碱法提取莜麦蛋白的研究还鲜见报道。试验研究莜麦蛋白的微波辅助减法提取工艺，在单因素基础上，应用响应面法优化莜麦蛋白的提取工艺，以期为莜麦蛋白的提取和莜麦资源的加工利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、设备与仪器

莜麦（蒙燕7413），产于内蒙古武川县。

石油醚（分析纯，天津永大化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市华东试剂厂）；盐酸（分析纯，天津市振兴化工试剂厂）；无水乙醇（分析纯，天津市永天化学试剂有限公司）；牛血清蛋白（北京拜尔迪生物公司）；考马斯亮蓝（分析纯，北京化学试剂公司）。

DFT-200 200克手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；JA5003电子分析天平（上海越平科技仪器有限公司）；L-550台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；PHS-3B型雷磁pH计（上海精密科学仪器有限公司）；WLS-l型微波炉（南京三乐微波研究所）；UV-7504单光束紫外-可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；KDN-08A定氮仪（上海昕瑞仪器仪表有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 莜麦蛋白的提取工艺

莜麦蛋白微波辅助碱提法：莜麦籽粒→磨粉→过筛→石油醚脱脂→脱脂莜麦粉→调浆→调pH→微波萃取→过滤→提取液→含量测定。

精确称取5 g脱脂莜麦粉于三角瓶中，按一定料液比加入蒸馏水，并用1 mol/L的NaOH溶液调pH，在一定功率的微波下浸提一定时间，以3 500 r/min离心15 min，分离上清液，通过考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白质含量，计算微波辅助碱法提取莜麦蛋白提取率。

1.2.2 莜麦蛋白提取率的计算

采用凯氏定氮法测定脱脂莜麦粉中总蛋白的含量，通过考马斯亮蓝G-250染色法测定提取液中蛋白质含量[20]。

1.2.3 统计处理

所有数据应用Excel软件、SPSS软件和Design-Expert软件进行处理和分析。其中，显著性分析采用Duncan检验，p＞0.05判定为变化不显著，p＜0.05判定为变化显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

以莜麦蛋白提取率为指标，分别研究微波功率（140，280，420，560和700 W）、pH（8，8.5，9，9.5，10和10.5）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g/mL））、提取时间（0.5，1，1.5，2和2.5 h）对莜麦蛋白提取率的影响。试验结果见表1，结果表明浸提液pH、微波功率、提取时间和料液比对莜麦蛋白提取率均有显著性影响。显著性分析结果表明在微波功率280 W、浸提pH 9.5、料液比1∶25（g/mL）、提取时间8.0 min的条件下，莜麦蛋白提取率最高。

图1 单因素试验结果

2.2 莜麦蛋白微波辅助碱提法工艺优化

在单因素试验结果的基础上根据Box-Behnken中心组合设计（BBD）的试验原理选择对莜麦蛋白提取率起主要影响的4个因素，以莜麦蛋白的提取率为考察指标进行四因素三水平的响应面分析试验，使用Design-Expert软件进行数据分析，求出数学模型，进而得到最佳的提取条件。莜麦蛋白微波辅助碱提试验设计及结果见表1和表2。

利用Design-Expert软件对表2的数据进行多元回归拟合，得到莜麦蛋白提取率对微波功率（A）、pH（B）、料液比（C）和微波时间（D）的回归方程：

表1 Box-Behnken方案设计的因素和水平编码值表

表2 微波辅助碱法提取莜麦蛋白响应面试验方案与试验结果

对该回归模型方差进行分析，具体结果见表3。由表3可知，模型p＜0.000 1，试验所选用的模型具有高度的显著性，失拟项p=0.262 8＞0.05，不显著，决定系数R2=0.946 9，说明拟合程度良好，试验误差小，该模型可以用来预测莜麦蛋白的提取率，模型中C、B2、C2、D2极显著，B、D显著，其他项系数均不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序为C＞D＞B＞A，即料液比＞微波时间＞pH＞微波功率。

表3 回归方程的方差分析

图2 两因素交互作用对莜麦蛋白提取率的响应面图和等高线图

等高线是椭圆形则表示两因素交互作用显著，是圆形则表示交互作用不显著，同时沿因素轴向等高线变化越密集，该因素对响应值影响越显著，反之越弱。根据分析结果做出响应面曲面图及等高线图，结果如图2所示。通过Design-Expert软件得到微波辅助莜麦蛋白碱提的最佳参数为微波功率382 W、pH 9.45、料液比1∶22.8（g/mL）、提取时间7.75 min，预测值为79.51%。调整为微波功率380 W、pH 9.45、料液比1∶23（g/mL）、提取时间7.75 min，该条件下莜麦蛋白的提取率为79.24%，与理论预测值吻合，因此基于响应面法所得的优化提取参数准确可靠。

3 结论

应用响应面分析法优化莜麦蛋白微波辅助碱法提取工艺，结果表明微波辅助碱法提取莜麦蛋白的最佳工艺参数为：微波功率380 W、pH 9.45，料液比1∶23（g/mL）、提取时间7.75 min。此条件下莜麦蛋白的提取率为79.24%。影响莜麦蛋白微波辅助碱法提取提取率的因素次序为：料液比＞微波时间＞pH＞微波功率。与常规碱法提取莜麦蛋白相比（提取时间1.15 h，提取率62.02%），微波辅助提取法能大幅减小提取时间，显著提高莜麦蛋白的提取率。