郭全友 朱彦祺,2 姜朝军 李保国
(1 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 2 上海理工大学医疗器械与食品学院 上海200093)
腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)属于革兰氏阴性菌,适宜低温下生长[1-2],能产生H2S、TMA、CH4SH 和(CH3)2S 等挥发性物质,腐败潜力强,被确认为有氧冷藏海水鱼的特定腐败菌(Specific spoilage organisms,SSO)[3-4]。研究者针对水产品腐败希瓦氏菌生态特性、生长动力学、货架期预测、靶向抑制和抑菌机制等进行了探究,如修艳辉等[5]研究了环境因子对大黄鱼腐败希瓦氏菌生长影响的计数法。蓝蔚青等[6]研究了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理。水产品在加工、销售、流通和贮藏过程中微生物受内在和外在因子的影响,特别在运输过程中温度易产生波动,多因子交互作用下可能产生拮抗和协同作用。
通过设置“抑菌栅栏”和改变栅栏强度达到抑制微生物的作用。采用微生物生长/非生长(Growth/no growth,N/NG)界面模型可定量分析不同栅栏下目标微生物生长的可能性 (或概率),获得不同环境因子下的生长/非生长信息,定量调节水产品内外环境,达到杀灭或抑制作用。微生物生长/非生长界面模型常采用Logistic 回归法[7],食品中微生物生长/非生长界限模型多为致病菌模型,如单增李斯特菌[8]、黄曲霉菌和蜡样芽孢杆菌等模型[9],用于控制微生物毒素的产生,保障食品安全。目前食品腐败菌模型的开发相对较少,如乳酸菌和结合酵母[10]等,通过定量控制微生物的生长/非生长,延长产品的货架期。人工神经网络(Artificial neural Network,ANN)在食品加工工程中已广泛应用[11],其中PNN(Probabilistic Neural Network)神经网络算法适用于生长/非生长模型的建立,具有结构简单和训练速度快的特点,可利用线性学习算法实现非线性学习算法的功能,对微生物生长/非生长数据进行快速分类[12-13]。采用Logistic 回归法和PNN 人工神经网络算法构建aw、pH 及盐分交互作用下腐败希瓦氏菌生长/非生长界面模型未见研究报道。
本文选取鱼源腐败希瓦氏菌为研究对象,研究室温(25 ℃)条件下pH、aw 及盐分(NaCl)对菌株腐败希瓦氏菌生长概率的交互影响,采用二阶线性Logistic 回归方程拟合和PNN 人工神经网络算法构建环境因子交互作用下生长/非生长界面模型。旨在评估鱼源腐败希瓦氏菌在pH、aw 和盐分范围的生长动态,开发高效抑菌及定量评估方法,为保障海产品鲜度和品质安全提供支持。
菌株D1 从低温有氧贮藏大黄鱼货架期终点时分离,16SrRNA 测序鉴定为腐败希瓦氏菌(序列号:KY786336),4 ℃保藏。
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB);胰蛋白大豆琼脂培养基 (TSA);1.0%盐酸;1.0%氢氧化钠;甘油和氯化钠(国药集团化学试剂有限公司,上海)。
水分活度仪(AW LAB-Touch PMB35),大昌华嘉商业中国有限公司;pH 计(pHS-3C),上海雷磁仪器厂;微生物生长测定仪 (Bioscreen C),芬兰;洁净工作台(SW-CJ-1FB),上海博讯实业有限公司医疗设备厂;低温培养箱(MIR-153),日本三洋公司。
采用TSB 作为培养基。参考文献[5]25 ℃时,pH≤5.0 或aw≤0.920 或NaCl≥12%时,腐败希瓦氏菌不生长,海水平均盐度为3.5%,故交互试验因素和水平设计如表1所示,选取均分水分活度0.90,0.92,0.94,0.96 作为训练集建立模型,为避免误差选择具有代表性的相同水分活度0.91 为验证集,计120 种工况,每种重复4 次和1 个空白平行。通过灭菌甘油调节水分活度,0.1 mol/L 稀盐酸和0.1 mol/L 氢氧化钠调节pH。
表1 腐败希瓦氏菌pH,aw 和盐分交互试验设计Table 1 The design of the group of the Shewanella putrefaciens under different pH,aw and NaCl
菌株活化:取腐败希瓦氏菌接种于无菌营养肉汤中,振荡30 s,25 ℃培养24 h,划线得到单菌落。
菌株接种:把调节过pH、aw 和盐分的TSB 经121 ℃灭菌后接入100 孔微孔板,每孔180 μL,取105CFU/mL 的菌悬液20 μL,最终接种液浓度为4.5 lgCFU/mL,接种入孔,每个条件4 组平行,1 个空白,25 ℃培养,每隔1 h 测定其OD600nm值,测试周期为7 d。
当试验结束时,微孔中出现明显沉淀物或混浊,OD 值高于空白3 倍则判定为生长[14-16],判定为生长时,取微孔中培养液100 μL 涂布于TSA 平板上,验证菌株是否仍为纯菌株。当OD 值1~3 倍之间时,涂布TSA 平板验证,若平板出现典型菌落,
菌数与初始菌量差>0.5 lgCFU/mL 时,则判定为生长。每种情况下的生长概率由重复孔的生长情况计算获得,如4 孔中2 孔生长则该情况下生长概率为50%。
1.6.1 Logistic 模型建立 依据试验设计选取90例数据为训练集用来建立模型,Logistic 模型如式1 所示[17]:
式中:p——生长/非生长概率;bi(0~9)——拟合参数;Na——盐分(V/V)。
1.6.2 PNN 人工神经网络模型建立 PNN 人工神经网络模型是基于Bayes 分类规则与Parzen 窗的概率密度函数估计方法发展而来的一种并行算法[18-19]。
将试验数据归一化后,依据试验设计选取90例数据,盐分、pH 和aw 作为三维向量进入输入层,在Matlab 软件中进行训练,输出层神经元设定为1,结构概率≤0.5 的记作1 类非生长,>0.5的记作2 类生长。训练完成后剩余30 例数据作为验证输入,验证训练模型的准确性。
1.7.1 拟合优度评价Logistic 模型 拟合优度采用似然比测试(-2lnL,the likehood test)、赤池信息准则(AIC=-2lnL+2k,Akaike's information criterion)、Hosmer-Lemeshow 测 试 (HL)和R2-Nagelkerke 进行评价。-2lnL、AIC 常用于模型拟合优度评判,数值越小,证明拟合效果越好。Hosmer-Lemeshow 用于评估模型任意数量的连续与分散的解释变量的拟合优度,数值越小,拟合效果越好,但无法将标准偏差纳入考虑,一个不理想的预测值亦可能导致该值的升高,故常结合R2-Nagelkerke 值一起考虑,R2-Nagelkerke 值主要反映了解释变量与响应变量间的关系,其值越接近1,拟合优度越好。
1.7.2 预测力评价 Logistic 模型与PNN 人工神经网络模型预测力采用C-matrix 获得的一致率(Fraction correct,FC)和假阳性率 (False alarm rate,FAR)进行比较,FC 值越接近于100%说明预测效果越好,FC 值为预测值与实际值的吻合度,FAR 为假阳性错判率,可作为模型的预测准确度的参考。公式如下:
选取30 例数据为验证集对模型进行验证,带入建立的Logistic 模型与PNN 人工神经网络模型中,采用FC%和FAR%模型验证的准确率和预测力进行评价。
使用SPSS18.0(美国IBM 公司)对模型进行拟合模型,通过Origin9.0(美国OriginLab 公司)绘制生长/非生长曲线,PNN 人工神经网络建立采用MatlabR2016b 进行建模。
2.1.1 Logistic 生长/非生长模型建立 腐败希瓦氏菌Logistic 回归模型的拟合参数如表2所示。对于二阶线性Logistic 方程,aw、盐分和pH2和aw2的作用对其生长情况有显著影响(P<0.01),其余参数在计算时差异性不显著,故剔除,腐败希瓦氏菌logistic 生长/非生长模型见式5:
二阶线性logistic 方程:
表2 Logistic 生长/非生长模型拟合参数Table 2 The parameters of the Logistic models
2.1.2 PNN 人工神经网络生长/非生长模型建立采用PNN 人工神经网络模型,建立了腐败希瓦氏菌隐含层数2,输出层神经元1 的PNN 模型。通过随机选取80%的数据训练网络,网络训练最优时间为0.1 s,得到PNN 模型,剩余20%数据再带入PNN 模型进行验证。PNN 网络测试诊断结果显示,30 例验证数据中有26 例数据符合试验情况分类,准确率为86.67%。
2.1.3 两种生长/非生长模型预测效果比较 腐败希瓦氏菌二阶线性logistic 方程训练集和验证集的FC 为93.8%与100%,FAR 分别为6%和0%,R2-Nagelkerke 为0.90,Hosmer-Lemeshow 的χ2=0.64 (P=1,Df=8),R2-Nagelkerke 参数接近1,且Hosmer-Lemeshow 参数值较小,说明该模型拟合优度良好[16,20]。陈琛等[9]利用二阶线性logistic方程建立了环境因子交互作用下蜡样芽孢杆菌生长/非生长模型,结果显示logistic 回归模型拟合优度较高,具有较广的适用范围,可避免对大系数的过度拟合,结果与本研究测试相符。
PNN 人工神经网络模型训练集一致率为100%,验证集FC 为86.67%,但验证集的FAR 比Logistic 模型高出6.25%。PNN 人工神经网络模型能短时间内对生长/非生长数据进行快速分类,且总体准确率较高,但仅能对生长/非生长数据进行分类,无法准确给出生长/非生长界面,仅能输出生长概率0 和1 的数值,即无法给出具体细致的生长概率,但其快速分类功能可为工业生产提供便利。M.Hajmeer[21]对大肠埃希氏菌(Escherichia coli R31)生长/非生长研究显示,同一组内基于PNN 的模型比基于FEBANN (Feedforward error backpropagation artificial neural networks)的模型更精确,且基于二阶logistic 回归模型比线性模型更准确,而处理分类问题时PNN 人工神经网络模型更优。可能由于研究对象的差异,本文基于PNN人工神经网络模型的验证集准确率低于Logistic模型。两种模型拟合优度和预测力比较如表3所示。
表3 两种生长/非生长模型拟合优度和预测力比较Table 3 Comparison of goodness of fit and predictive power of two growth / non-growth models
2.2.1 盐分对腐败希瓦氏菌生长概率的影响 图1(a~d)为盐分1.0%~4.0%,腐败希瓦氏菌生长概率预测值。图1Logistic 模型预测曲线 (实线)显示:盐分1.0%,aw0.96 和0.94 时,生长概率随pH的增大而增大,最终生长概率达到1;aw0.92 和0.91 时,生长概率在pH 5.2 和6.4 时开始增大,最终生长概率到达1 和0.45;盐分1.0%,aw0.90时,无论pH 如何变化,该交互作用下腐败希瓦氏菌均不生长。虚线为PNN 人工神经网络模型的预测情况,变化趋势与实线近似,生长概率≤0.5 时视作非生长,>0.5 时视为生长,没有缓慢变化区域,生长概率直接从0 上升到1。aw0.92,pH=5.9处出现拐点,生长概率预测值从0 上升到1。
盐分2.0%时,实线显示aw0.96,0.94 和0.92时,生长概率随pH 增大逐渐增大,最终达到1;aw0.91 时,生长概率从pH 6.5 时开始增大,pH 7时达到1;盐分2.0%,aw0.90 时,无论pH 如何变化,该交互作用下腐败希瓦氏菌均不生长。图1虚线在aw 0.92,pH<6.5 时预测与实线不完全统一,在pH 6.2 时实线预测的概率>0.5,但虚线预测仍为0,其差别原因可能是由于2 种建模方式的个体差异、训练集数据的选取差异等造成的。
盐分3.0%和4.0%时,实线显示aw 0.91 时,生长概率分别在pH 6.7 和6.9 时开始增大,最终到达0.06 和0.02。盐分越高,pH 与aw 的交互作用逐渐加强,腐败希瓦氏菌不适宜生长,生长界限开始变化点趋于高pH 范围,高盐分对腐败希瓦氏菌有生长抑制作用,其趋势与虚线相同。
图1 2 种模型盐分作用下腐败希瓦氏菌生长概率预测值Fig.1 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciens by salty with two models
修艳辉等[5]对环境单因子对腐败希瓦氏菌生长/非生长界限做了研究,表明25 ℃时生长概率随盐分的增加而逐渐降低,当盐分≥12%时腐败希瓦氏菌均不生长,与本研究结果趋势相符,但由于其为单因素试验故有一定差异。研究显示[22]Shewanella amazonensis 细胞膜成分变化可能是高NaCl 胁迫的间接生理响应,当NaCl 为9.35%时,生长速率被抑制至原来的50%。随着盐分的增长,腐败希瓦氏菌生长受到抑制,生长界限向高pH、高aw 方向偏移;aw≤0.91 时,均不生长。
2.2.2 aw 对腐败希瓦氏菌生长概率的影响 图2(a~d)中logistic 模型预测曲线(实线)为腐败希瓦氏菌,aw 对腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值。aw0.90 时,该交互作用下腐败希瓦氏菌均不生长。aw0.91 时,盐分1.0%~4.0%条件下,生长概率在pH=6.4,6.5,6.7 和6.9 时开始增大,最终生长概率分别达到0.45,0.19,0.06 和0.02,该交互作用下腐败希瓦氏菌生长概率很低,生长基本受到抑制。aw0.92,0.94 和0.96 时,生长概率受盐分影响逐渐减小,随pH 增大而增大,生长概率上升变化陡峭。aw 越高,pH 与盐分的交互作用就被减弱,腐败希瓦氏菌越适宜生长。
图2中PNN 人工神经网络预测结果(虚线),与Logistic 模型预测曲线结果相似,生长/非生长0,1 分界点在Logistic 模型预测曲线中位于生长概率0.5 附近,将生长概率<0.5 的情况视作不生长,无法观测到水分活度0.91 时,pH 大于6.5 之后的生长概率变化,实际生长概率有小幅上升趋势。aw0.92 时,盐分1%~4%条件下,分别在pH=6.0,6.3,6.4,6.5 处出现拐点,生长概率预测值由0变为1;aw0.94,0.96 变化趋势与实线相似。
aw 反映水分与食品结合程度,是微生物酶和化学反应能触及的水分,是微生物生长繁殖的重要因素[23],学者[24]利用山鸡椒油改变产品aw,显示浓度越高腐败菌抑菌圈直径越大,且破坏细胞结构,抑制糖类和蛋白质的消耗,抑制琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活性,需要对aw 对腐败菌生长抑制机制进行深入研究。
图2 2 种模型下aw 对腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值对比Fig.2 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciens by water activity under two models
2.2.3 pH 值对腐败希瓦氏菌生长概率的影响图3(a~f)为pH=4.5~7.0 时,腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值。图中实线为Logistic 模型预测的生长/非生长曲线,其中pH 4.5 时,腐败希瓦氏菌的生长受到强烈抑制。pH 5.0 时,aw=0.96 且盐分≤3%生长概率大于0.5。pH 5.5 时,aw0.96,0.94 时,随盐分增长腐败希瓦氏菌生长概率从1.00 下降到0.86,其余水分活度均不生长。pH 6.0 时,aw>0.92 条件下生长概率均为1,aw0.92 条件下,生长概率随盐分增大而下降,aw<0.92 条件下均不生长。pH 6.5 与7.0 时,随盐分的增大腐败希瓦氏菌的生长概率在aw0.92 与0.91 时逐渐递减。图3(a~f)虚线为PNN 神经网络预测曲线,与logistic模型预测曲线结果相似,但无法表示生长概率变化的范围及过程,仅可显示拐点。pH 5.0,aw=0.96,盐分3%时以及pH 6.5,aw=0.92,盐分4%为生长概率预测值拐点,生长概率从1 变为0。
Jung-HoonYoon 等[25]研究显示希瓦氏菌属最适生长pH 值在7.0 到8.0 之间,与本研究结果一致。研究[26]表明pH 变化会影响腐败希瓦氏菌表面超微结构,改变扬氏模量和细胞弹簧常数,pH 减小会导致细胞壁厚度变小,破坏细胞膜完整性。在生产过程中可适当添加有机酸调节pH,其抑菌机理包括能量竞争、透化细菌外膜、提高胞内渗透压、抑制生物大分子合成和诱导宿主产生抗菌肽等作用[27],腐败希瓦氏菌生长概率随pH 减小而减小,其生长概率作用机理有待深入研究。
1)建立了腐败希瓦氏菌二阶线性Logistic 模型和PNN 人工神经网络模型来预测其生长/非生长情况。二阶线性logistic 模型和PNN 人工神经网络模型的训练集一致率分别为93.80%和100.00%,验证集一致率分别为100.00%和86.67%。PNN 网络能对生长/非生长数据进行快速分类,但二阶线性logistic 模型能更好的反映腐败希瓦氏菌的生长概率预测,生长/非生长模型为:
图3 2 种模型下pH 对腐败希瓦氏菌生长概率影响预测值对比Fig.3 The influence of the growth probability of Shewanella putrefaciensby pH under two models
logit(P)=-9 847.799+20 712.603×aw-1.237×NaCl+0.567×pH2-10 901.375×aw2
2)随着盐分增长,腐败希瓦氏菌生长/非生长界限小幅度向高aw,高pH 方向移动,高盐分对腐败希瓦氏菌有生长抑制作用。aw≤0.91 时,菌株均不生长,aw=0.92,0.94 和0.96 时,腐败希瓦氏菌生长概率随pH 增大而增大,上升变化陡峭。pH=4.5 时,腐败希瓦氏菌基本不生长,随pH 升高,高aw 情况下的生长概率先增长到1。