Björnstad综合征致病BCS1L基因的新发突变位点研究

李思源 刘婷婷 杨淑霞 马圣清 杨勇

北京大学第一医院皮肤科 北京市皮肤病分子诊断重点实验室 国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心 100034

杨勇现在中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院遗传病中心工作，南京210042

Björnstad 综合征（Björnstad syndrome）又名扭曲发综合征，是一种罕见的先天性遗传性疾病，由Björnstad于1965年首次报道，其主要临床特征为先天性头发扭曲和感音性听力丧失。BCS1L为其致病基因，编码一种泛素-细胞色素C还原酶复合体伴侣蛋白，突变后破坏线粒体呼吸小体的组装，降低线粒体电子传递链的活性，增加活性氧的产生，使得对线粒体功能敏感的毛囊和听觉毛细胞产生氧化应激损伤，从而表现为先天性头发扭曲和感音性听力丧失。BCS1L基因突变的病例主要集中在北美和北欧等地区，而国内相关报道较少。我们对收集到的1例Björnstad综合征患者进行BCS1L基因突变研究，以期进一步探究BCS1L基因突变与临床表型之间的联系。

对象与方法

一、对象

患者女，25岁，自出生起即头发稀疏、扭曲且生长速度慢，头发干枯无光泽，易断裂，无头皮瘙痒；眉毛稀，睫毛短（图1）。家长述患者自幼听力正常，无听力障碍，12岁时为改善毛发问题，于后颈部注射不明成分的针剂长达1年，随后突发耳鸣。听力检查示：双耳听力障碍，左耳平均听力85.6 dB，右耳92.9 dB，属于极重度听力障碍，言语识别率0。体检：一般情况良好，身高、体重、智力发育正常。血清微量元素（铜、锌、铁、钙、镁）以及生长激素和性激素检测正常。父母否认近亲婚配，其母妊娠时无特殊疾病和特殊用药史，患者的父母、姐姐及其余家庭成员均未出现头发扭曲或听力障碍等症状。

图1 Björnstad综合征患者临床表现 头发稀疏扭曲，眉毛稀疏。1A：正面照；1B：侧面照

二、方法

1.外周血DNA提取：本研究经北京大学第一医院伦理委员会批准（2016［1024］），患者及家属签署知情同意书后，采集患者及其父母外周静脉血2 ml，用2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，常规低渗溶血，酚-氯仿法提取外周血白细胞DNA。

2.聚合酶链反应（PCR）引物设计：根据BCS1L基因序列（来源于ensemble网站，网址：http：//asia.ensembl.org/index.html），利用NCBI primer-blast（网址 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计7对特异性引物，扩增患者及其父母BCS1L基因全部外显子和侧翼序列，第4号外显子引物序列为：上游5′-CAGTACCCGTACTCAGCACC-3′，下游5′-TAGCCAAAGGGACGCCATTC-3′；第8号外显子引物序列为：上游5′-GCCTCTCTGATGACCGACTC-3′，下游 5′-TGAGCAGTAGCCCACGTACT-3′，引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

3.PCR反应体系及条件：以PCR DNA扩增仪（Eppendorf，德国）进行PCR反应，反应体系25 μl：2 × KAPA2G Fast Genotying Mix 12.5 μl，上下游引物各1.0 μl（10 pmol/μl），DNA 1 μl（约200 ng），补充ddH2O至25 μl；扩增条件：94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃适温延伸45 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，所有PCR产物经纯化后送至北京天一辉远生物科技有限公司，包括目的外显子所有序列以及两侧至少30 bp侧翼序列，经ABI3730xl全自动DNA测序仪测序，结果与Ensemble genome browse所公布的序列双向对比，使用BioEdit sequence Alignment Editor软件进行分析，并通过预测软件（http：//www.mutationtaster.org/）对突变位点进行预测。

图2 Björnstad综合征先证者及其父母的BCS1L基因突变分析 先证者BCS1L基因第4号外显子发生c.430 C＞T杂合突变（p.R144*），第8号外显子发生c.917 G＞A杂合突变（p.R306H）；先证者父亲BCS1L基因第4号外显子正常，第8号外显子发生c.917 G＞A杂合突变（p.R306H）；先证者母亲的BCS1L基因第4号外显子发生c.430 C＞T杂合突变（p.R144*），第8号外显子正常

4.电镜检查：用细镊子轻取患者头发若干根，送至电镜室进行样本处理并使用扫描电镜（AmRay 1000A）检查。

结 果

一、PCR扩增结果

以该患者及其父母的DNA为模板，7对引物均可扩增出各自产物，长度为436～714 bp。

二、DNA测序结果

患者BCS1L基因第4号外显子上存在杂合无义突变（图2）：第430位碱基发生C→T（c.C430T）杂合突变，使第144位密码子CGA→TGA，导致其编码氨基酸序列由精氨酸突变为终止密码子（p.R144*），通过预测软件（http：//www.mutationtaster.org/）进行预测，显示出现无义介导的mRNA降解而致病，该预测结果高度可信（得分为1）；第8号外显子上存在杂合错义突变（图2）：第917位碱基发生G→A（c.G917A）杂合突变，使第 306位密码子CGC→CAC，导致其编码氨基酸序列由精氨酸突变为组氨酸（p.R306H）。对先证者父母BCS1L基因进行测序，结果显示，其父母均为携带者：患者父亲的BCS1L基因第8号外显子发生c.917 G＞A杂合突变（p.R306H），第4号外显子正常（图2）；患者母亲的BCS1L基因在第4号外显子发生c.430 C＞T杂合突变（p.R144*），第8号外显子正常（图2）。突变均由反向测序得到验证。

三、电镜检查结果

扫描电镜下见患者头发以不规则的间隔出现扁平、沟槽和沿长轴扭曲，发干表面毛小皮边缘不清、粗糙，伴部分翘起（图3）。

讨 论

Björnstad综合征为常染色体隐性遗传，患者通常出生后不久即出现头发异常，包括头发扭曲，无规则扁平，生长速度慢，发质干枯无光泽，易断裂，随着年龄增长而加重，眉毛、睫毛亦可受累。电镜下发干以不规则的间隔出现沟槽，绕轴旋转，从而引起毛发的自发性断裂，发干表面毛小皮边缘不清、粗糙，伴部分翘起。

图3 Björnstad综合征先证者毛发扫描电镜图像 3A：头发出现扁平、凹槽和纵嵴，毛小皮边缘不清、粗糙，伴部分翘起（×500）；3B：头发出现沿发干长轴的扭曲（×500）

扭曲发的形成可以是先天性的，也可以继发于各种原因的斑秃而引起［1］。先天性扭曲发亦可见于各种罕见的综合征，如：Crandall综合征［2］、Menkes综合征［3］、外胚层发育不良、神经缺陷和代谢紊乱等，可通过基因测序，检测血清铜、生长激素、性激素水平等方法鉴别。

1965年，Björnstad首先将先天性头发扭曲和感音性听力丧失作为一组遗传表型，报告了8例扭曲发患者，其中5例并发感音性听力障碍，并建议扭曲发的低龄儿童应尽早进行听力测试［4］。1998年，Lubianca Neto等［1］将 Björnstad 综合征的致病基因定位于染色体2q34-36。2007年，该课题组研究发现，BCS1L基因编码一种泛素-细胞色素C还原酶复合体伴侣蛋白，位于线粒体内膜上，在线粒体呼吸链组装中帮助Fe/S蛋白插入到复合体Ⅲ的前体中，是线粒体呼吸链复合体组装所必需的伴侣蛋白［5］。BCS1L蛋白包含两个功能域：促进线粒体内膜的易位及插入区域（1～89个氨基酸）和ATP活动相关的ATP酶家族的区域（220～399个氨基酸）。而突变基因编码形成的BCS1L蛋白改变了蛋白之间的相互作用，增加了缺乏Fe/S蛋白插入的线粒体呼吸链复合体Ⅲ前体的积累，破坏了线粒体呼吸小体（人类线粒体呼吸作用的基本单位）的组装，降低了线粒体电子传递链的活性，增加了活性氧的产生。

BCS1L基因突变导致的Björnstad综合征显示了耳朵和头发组织对线粒体功能的敏感性，特别是对活性氧产生的敏感性，快速分裂的毛囊细胞较容易受到活性氧水平增加的影响，而已有模型支持活性氧水平对耳毒性的作用，如耳毒性抗生素对听觉毛细胞造成的氧化应激损伤［6］等。除了仅有耳朵和毛发受累的Björnstad综合征之外，BCS1L基因突变造成的线粒体呼吸链复合体Ⅲ的缺乏，也会导致其他广泛的疾病表型：如神经系统疾病［7］，局灶性癫痫、肌无力和视网膜萎缩，以及更为严重的线粒体复合体Ⅲ缺乏症［8］（出生时出现代谢性酸中毒、新生儿近端肾小管病变、肝脏损害和神经受累）和Gracile综合征［9］（表现为生长迟缓、氨基酸尿、胆汁淤积、铁超载和乳酸中毒以及早夭）等，后两者为严重的线粒体疾病，是新生儿致命性疾病。

从基因学角度分析，所有BCS1L基因突变均破坏了线粒体呼吸小体的组装，降低了线粒体电子传递链的活性，并且增加了活性氧的产生。而活性氧的产生情况与BCS1L基因突变的临床表型严重程度相关。此外，BCS1L基因突变造成的表型差异也可能与线粒体的异质性、组织对能量需求的可变性以及组织对活性氧的敏感性有关。国外蛋白组学研究显示，BCS1L蛋白存在p.I106*、p.R114W、p.R183H、p.A273fs*27、p.R291*、p.Q302E、p.R306H等改变的病人仅出现典型的Björnstad综合征特征——出生时即表现出毛发异常以及先天性听力障碍，无其他疾病表现；当BCS1L蛋白存在p.G35R和 p.R184C［5］突变时，患者除了具有典型的Björnstad综合征特征外，还存在如生长迟缓、发育迟缓和肌张力减退等轻度线粒体复合体Ⅲ缺乏症的表现；当患者BCS1L蛋白存在p.R56*、p.S78G、p.P99L、p.R144Q、p.R155P、p.S277N、p.V327A、p.V353M等突变时，表现出了更为严重的线粒体复合体Ⅲ缺乏症和Gracile综合征的临床表型。患者复杂的多系统临床表现以及早夭限制了对BCS1L基因不同突变位点及其对应临床表型的研究。国内报道的BCS1L基因突变致病的病例［10］较少，且均为Björnstad综合征，突变位点包括p.R306C和p.R186*［11］、p.A273fs*27 和 p.R306H［12］等，而线粒体复合体Ⅲ缺乏症和Gracile综合征尚未见报道。

本文报告的患者自幼毛发稀疏、扭曲，但听力正常；其听力障碍出现时间较晚，并且有药物诱发因素存在，而又区别于药物中毒性耳聋的听觉系统慢性中毒（常出现于治疗后1～2周，逐渐加重）及可能的前庭系统受累（可出现眩晕和平衡失调）症状，本例患者的听力障碍发生于持续用药1年后，无渐进性加重过程，无前庭系统受累表现。对本例患者及其父母的BCS1L基因进行测序，结果显示，患者第4号外显子发生c.430 C＞T杂合突变（p.R144*），其母亲为该突变的携带者；患者第8号外显子发生c.917 G＞A杂合突变（p.R306H），其父亲为该突变的携带者。患者BCS1L基因第4号外显子c.430 C＞T杂合突变（p.R144*）为该基因突变导致Björnstad综合征的新发致病突变位点，既往虽有第144位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺（p.R144Q）的报道［5］，但突变为终止密码子的报告尚属国际首例，通过预测软件（http：//www.mutationtaster.org/）预测，显示BCS1L基因第4号外显子发生c.430 C＞T杂合突变后出现无义介导的mRNA降解，该预测结果高度可信（得分为1），推测提前终止的BCS1L蛋白出现了功能缺失而致病；第8号外显子上的突变位点位于BCS1L蛋白的ATP活动相关的ATP酶家族功能域的外表面，既往文献已报道该点突变影响了BCS1L蛋白与其他蛋白的相互作用，进而影响线粒体呼吸链ATP依赖的组装过程，从而导致疾病的发生［5］。结合患者的毛发异常及其BCS1L基因的突变情况，诊断为Björnstad综合征，并对其不典型的听力障碍进行报告。目前本例患者仍在随访中。

综上所述，本文在既往研究的基础上，首次报道BCS1L基因第144位密码子CGA→TGA导致的编码终止为该基因突变导致Björnstad综合征的新发致病突变位点，为进一步明确Björnstad综合征基因型和表型的关系积累了新证据。随着分子遗传学的进展，可以通过基因诊断，对患者进行预后评估，也可以通过产前诊断，阻止疾病在家族中的延续。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突