负载姜黄素支架体内构建组织工程软骨的可行性研究

KANG BO KYOUNG 陈维明 周广东 曹德君

外伤、肿瘤、炎症等造成的软骨病变和缺损临床较为常见，且软骨无血管神经，损伤后极难自我修复[1]，严重影响患者的身心健康。目前，软骨缺损可通过软骨组织移植、软骨细胞或间充质干细胞移植、生物材料填充等方法进行修复重建[2]，但这些方法均存在一定的局限性，如自体软骨来源有限，异体软骨排斥反应，人工材料外露等。因此，软骨缺损修复和功能重建仍是外科治疗的难题[2]。近年来，快速发展的组织工程技术为解决上述难题提供了新的方向。组织工程技术主要包括种子细胞、支架材料、细胞因子等要素。自体软骨细胞是目前软骨再生的重要种子细胞来源，但由于自体软骨细胞来源有限，取材创伤大，体外扩增后易老化和去分化，丧失软骨再生能力，很难在临床上推广应用。

因此，增殖能力强又具有多向分化潜能的干细胞成为研究热点。BMSC具有取材方便、创伤相对小、可重复取材、增殖能力旺盛、软骨再生能力强等优势，使其成为软骨再生的理想种子细胞[3-4]。但BMSC体外构建的软骨在皮下环境易发生骨化，最终导致软骨再生失败[5]。我们的前期研究证实，软骨细胞体外构建的软骨植入皮下后可形成稳定的软骨，很少骨化，主要是因为软骨细胞本身可以分泌血管抑制因子[6]。但是，利用BMSC体外构建的软骨植入皮下后，很容易发生血管侵入和基质钙盐沉积，不能形成稳定的软骨组织。因此，BMSC再生软骨皮下异位骨化很可能与抗血管化因子不足以抵抗皮下环境中的促血管化因子有关。因此，寻找对抗促血管化因素的方法，可能是克服BMSC体外构建软骨异位骨化的关键[7-9]。

姜黄素具有抗肿瘤血管生成的作用[10]，主要是通过作用于血管内皮生长因子及其受体而抑制血管的生成。研究表明，姜黄素可明显抑制艾氏腹水癌细胞在荷瘤小鼠体内形成的实体肿瘤的血管形成，说明姜黄素是一种特异性血管生成抑制剂[10-16]。因此，本研究拟探讨负载姜黄素的支架材料能否通过抑制血管化而调控软骨再生，希望为BMSC构建软骨组织的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大白兔5只(甲干生物有限公司)，雌雄不限，体质量4～5 Kg；BALB/c裸鼠(中科院动物所)30只，雌雄不限。上海白山羊 1只(甲干生物有限公司)。

1.2 实验材料

姜黄素(百灵威科技有限公司)，人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，hUVEC)(上海歌凡生物科技有限公司)，低糖 DMEM 培养基、高糖 DMEM 培养基、胎牛血清、0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液(Hyclone，美国)，青霉素、链霉素混合液(Gibco，美国)，Ⅱ型胶原酶(Gibco，美国)，明胶 (阿拉丁试剂有限公司)。

1.3 细胞来源与扩增

1.3.1hUVEC

镜下观察hUVEC生长情况，当细胞融汇至80%左右，置于37 ℃培养箱预温3 h后，0.05%胰酶-EDTA消化传代。1 000 r/min离心5 min，重悬细胞。更换新的细胞培养瓶，加入含15% FBS的低糖DMEM，按1∶3分装至3个培养皿中， 37 ℃、5%CO2培养箱培养。细胞生长至培养皿底面80%～85%时使用。

1.3.2羊BMSC

无菌抽取羊的髂骨骨髓，加入骨髓体积1∶1～2∶1的无血清培养基。1 800 r/min离心8 min，弃去1/2的培养液，再加入无血清低糖DMEM培养基15～30 mL。1 800 r/min 离心8 min，弃去2/3的培养基。移入新的离心管，加入含15%FBS的低糖DMEM培养基。调节细胞浓度至1×108cells/L，37 ℃、5%CO2培养箱培养。原代培养72 h后首次半量换液，以后每3天换液1次。当细胞生长至培养皿底面80%～85%时，0.05%胰蛋白酶-EDTA消化传代。1 500 r/min离心8 min，再加入含15% FBS的低糖DMEM，按1∶3分装至3个培养皿中，置于37 ℃、5%CO2培养箱继续培养。本实验所用细胞均为第2代BMSC。

1.3.3兔耳软骨细胞的分离与培养

无菌剪取单侧兔耳上1/3，去除周围的软组织，将耳软骨切成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入5倍体积的0.25% Ⅱ型胶原酶，摇床消化过夜；75 μm孔径滤网过滤，1 500 r/min离心5 min，PBS漂洗2遍，以含10%FBS的高糖DMEM配制成细胞悬液，按2×106个/皿(直径10 cm培养皿)接种细胞，置入5%CO2、37 ℃培养箱培养。细胞达90%融合时进行传代。本实验所用细胞均为第2代软骨细胞[1]。

1.4 姜黄素储备液的配制

标准品配制：姜黄素分子量为368.38 g/mol。将姜黄素溶解于完全避光的DMSO中，配制成浓度10 mmol/L的姜黄素储备液，此液体可在4 ℃下保存2周。进行测试时，需要配置不同浓度的应用液,以姜黄素储备液进行稀释, 现用现配。

1.5 不同浓度的姜黄素溶液与细胞划痕实验

按照姜黄素分子量配制3个不同浓度的姜黄素溶液：30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L；6孔板上接种hUVEC，细胞浓度均为2×105cells/mL(n=3)；另一6孔板接种BMSC，细胞浓度均为2×105cells/mL(n=3)；37 ℃、5%CO2培养24 h，细胞必须长满(100%)；待细胞长满后，用枪头比着直尺(高压灭菌的钢尺)，垂至于背后的横线划痕，划1道(枪头必须要垂直，不能倾斜)；用PBS洗1～2次，去除划下的细胞；对照组孔里加无血清培养基，实验组孔里加不同浓度的姜黄素溶液；0 h、6 h、12 h、24 h和48 h后取样本拍照，并统计数据。

1.6 负载姜黄素支架材料的制备

将1.5 g明胶置入含有100 mL去离子水中，60 ℃水浴加热，不断搅拌至明胶溶解；将溶解的明胶溶液倒入48孔板中，放入-20 ℃冰箱冷冻24 h，再放入真空冷冻干燥箱中48 h，将样品完全干燥；将0.5 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3 g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于95%乙醇中，配置EDC/NHS化学交联液；将支架放入上述交联液中交联12 h；然后用去离子水多次冲洗，去除交联剂，得到明胶支架，设为对照组；配置姜黄素溶液：将2 mg姜黄素溶于无水乙醇中(含5%冰醋酸)，将明胶支架置于姜黄素溶液中2 h，去离子水冲洗，得到负载姜黄素支架，设为实验组。将两组支架再次放入-20 ℃的冰箱中冷冻24 h、真空冷冻干燥箱中干燥48 h至样品完全干燥。将支架材料切成直径9 mm、厚度约 2 mm的圆片备用。

1.7 扫描电镜观察

将明胶支架(对照组)和负载姜黄素支架(实验组)用剪刀剪切成小片(半圆形，直径5 mm)，导电胶固定，喷金，黏托，扫描电镜观察两组材料的微观结构[2]。每个试样取3个平行样品。

1.8 细胞-材料复合物的制备

将直径9 mm、厚度约2 mm的圆片(对照组为明胶支架，实验组为负载姜黄素支架)在真空冷冻干燥机进行过夜冷冻干燥灭菌处理，再紫外线照射15 min(波长240 nm，能量30 W)；将第 2代软骨细胞用高糖DMEM培养液制备成5×107cells/mL浓度的细胞悬液；两组材料各加入130 μL细胞悬液，然后将构建的细胞-材料复合物放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h，然后慢慢加入含10%FBS的高糖DMEM培养液覆盖复合物，放入37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。体外培养1周后，将复合物植入裸鼠皮下。

1.9 组织学检测

1.9.1单纯材料支架

将负载姜黄素支架材料与明胶支架分别植入裸鼠皮下，3、6周后取材，行组织学检测(HE、番红O-固绿染色)。

1.9.2细胞-材料复合物

两组细胞-材料复合物体外培养1周后，分别植入BALB/c裸鼠背部皮下左右两侧。3、6周后取出，行HE、番红O-固绿、Ⅱ型胶原免疫组化检测。

2 结果

2.1 细胞形态

2.1.1hUVEC

细胞贴壁第1天，达到80%～85%融合，hUVEC均呈典型的漩涡状生长，细胞呈多角形、短粗的梭形，细胞增殖力和活力佳(图1)。

图1 人脐静脉内皮细胞(标尺：50 μm)

2.1.2BMSC

原代BMSC贴壁后第5天，慢慢开始出现克隆性增长表现。在显微镜下观察到透亮的贴壁和未贴壁的细胞，传代后，高倍镜下可见BMSC大多呈梭形或者多角形(图2)。

图2 第1代羊BMSC(标尺：50 μm)

2.2 细胞划痕实验

hUVEC细胞划痕实验结果显示：姜黄素浓度为30 μmol/L，12 h开始出现hUVEC细胞凋亡现象。BMSC细胞划痕实验结果显示：姜黄素浓度在40 μmol/L以下时，未观察到BMSC出现凋亡现象。说明姜黄素浓度在40 μmol/L以下不会影响BMSC的生长。

因此，姜黄素的最佳浓度范围为30～40 μmol/L，既可抑制hUVEC生长又不影响BMSC增殖(图3、4)。

图4 BMSC细胞划痕实验(标尺：100 μm)

2.3 支架材料大体观察、扫描电镜观察

大体观察显示，对照组呈白色，实验组呈黄色，此外两组并无明显不同。扫描电镜观察显示，两组支架材料均分布均匀，具有一定孔隙率，无颗粒状物质附着(图5)。

2.5 支架材料皮下植入后大体观察

对照组和实验组支架材料皮下植入3、6周后，大体观察显示，对照组有明显的血管化现象，而实验组周围血管化受到明显抑制，提示姜黄素具有明显的血管抑制作用(图6)。

图6 支架材料皮下植入后大体观察

2.6 支架材料皮下植入后组织学观察

体内培养3周后取材，HE、番红-固绿染色显示，两组样本均有部分被吸收，对照组可观察到明显的血管分布，实验组未观察到明显的血管分布。体内培养6周后取材，对照组被吸收的程度比实验组更明显，实验组未观察到明显血管分布(图7、8)。

图7 支架材料皮下植入3周后组织学观察(标尺：500 μm)

图8 支架材料皮下植入6周后组织学观察(标尺：500 μm)

2.7 细胞-材料复合物体内构建的大体观察

大体观察显示对照组有大部分区域呈现明显的红色外观，实验组呈瓷白色的软骨样外观，未见明显红色样改变。实验组和对照组外观均一，未见明显的大小变化(图9)。

2.8 细胞-材料复合物体内构建的组织学观察

组织学观察显示，细胞-材料复合物体内构建3、6周，两组细胞-材料复合物均有软骨陷窝形成。体内培养3周，实验组软骨陷窝形成较对照组更为明显(图10)；体内培养6周，两组均有成熟的软骨陷窝形成，两组未见明显差异，提示负载姜黄素未对皮下环境的软骨再生产生明显的不良影响(图11)。

图10 细胞-材料复合物皮下植入3周后组织学观察(标尺：500 μm)

图11 细胞-材料复合物皮下植入6周后组织学观察(标尺：200 μm)

3 讨论

目前BMSC体外构建软骨在皮下环境中异位骨化是公认的难题，一般认为异位骨化主要与血管化有关，因此解决该难题的关键就是抑制血管化。姜黄素具有抗肿瘤血管生成作用，可通过抑制血管内皮生长因子及其受体而抑制荷瘤小鼠艾氏腹水癌细胞形成的实体肿瘤的血管形成，说明姜黄素是一种特异性血管生成抑制剂[10-16]。

使用软骨细胞体外构建的软骨样组织植入皮下后可以形成稳定的软骨，很少发生骨化，但是利用BMSC体外构建的软骨植入皮下后却很容易发生血管侵入和基质钙盐沉积，不能形成稳定的软骨组织。皮下环境不利于BMSC诱导的软骨生长，而且单纯BMSC诱导的软骨植入皮下后产生的抗血管化因子不足以抵抗皮下环境中的促血管化因子，造成失衡。

本研究设置不同浓度的姜黄素溶液，细胞划痕实验结果显示，姜黄素浓度为30 μmol/L时，12 h即出现hUVEC细胞凋亡，而姜黄素浓度在40 μmol/L以下时未观察到BMSC细胞凋亡，说明姜黄素合适的浓度范围为30～40 μmol/L，是既可抑制hUVEC生长又不影响BMSC增殖的最佳浓度范围。

对照组和实验组材料分别植入裸鼠皮下后，结果显示，两组支架材料分布比较均匀，具有一定孔隙率，无颗粒状物质附着。这说明姜黄素能够很好地溶解于明胶材料中，并未存留不溶物，且不影响明胶材料的微观结构。组织学观察显示实验组呈现了明显的血管抑制现象。这对于后期进一步研究姜黄素通过抑制血管化来调控干细胞的异位骨化至关重要。

另外，组织学观察显示，体内植入3周、6周后，两组细胞-材料复合物均有软骨陷窝形成，未见明显差异，提示负载姜黄素后未对皮下环境的软骨再生产生明显的不良影响。

本研究表明，抗血管化药物姜黄素对软骨细胞生长无害，不引起炎症反应，对软骨细胞无明显破坏。本研究结果对于今后应用姜黄素参与以BMSC为种子细胞构建组织工程软骨提供了依据。