NOG R167G突变致先天性指间关节黏连

崔恒庆 孙滨 方霞 周晟博 杨皓然 戴心怡 韩刚 王斌

先天性指间关节黏连(Symphalangism，SYM1；MIM#185 800)是一种罕见的常染色体显性遗传病，遗传异质性极小，外显率高。该病最早在1960年由Vesell等[1]描述。SYM1最常见的症状是手指和脚趾近端指(趾)间关节(PIP)僵硬，手指指横纹消失。一般尺侧手指较桡侧手指发病率高，拇指较少累及。部分患者还可伴有传导性耳聋、先天性远视、短指、掌骨缩短和手足远端指(趾)骨发育不良等[2]。

该病目前主要的治疗方法为手术松解，但术后黏连复发率高，多数患儿最终因手指关节骨性融合而部分丧失手部功能，严重影响患儿日常活动，少数患儿因自卑情绪伴发心理障碍。该病多为先天性，代系遗传表型逐渐加重，且3岁以内多发生关节完全融合而失去手术治疗机会。因此，明确致病基因，结合胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是阻断致病基因代系遗传，减少该病发生的有效方法。本研究针对一个中国先天性指间关节黏连家系进行了遗传学研究，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 家系信息

在这个三代患病家系中，具有先天性关节黏连表型的有2位。Ⅱ2母亲双手示、中、环、小指手指近节无法弯曲，指横纹消失，手指远节短小。先证者Ⅲ2 双侧中、环、小指手指近节屈曲受限，手指及足趾短指(趾)畸形(图1)。本研究经我院伦理委员会批准(编号：SH9H-2018-T50-2)，患者及亲属均已签署知情同意书。

图1 先天性指间关节黏连家系图及其临床表现

1.2 方法

1.2.1DNA提取

收集两例患者Ⅱ2、Ⅲ2及两例正常成员Ⅱ1、Ⅲ1外周静脉血样。按照凯杰DNA抽提试剂盒(Qiagen，德国)说明书，分离提取上述样品基因组DNA，溶于40 μL水后，-80 ℃保存备用。

1.2.2PCR扩增及Sanger测序

针对NOG基因(GenBank编号NM_005450.4)，设计了一对引物(F：5′-ccgcgggctcggcggtgctctctctctctctctctct-3′，R：5′-gatgggaatgccagagcg-3′)。扩增体积为30 μL，含100 ng gDNA、200 nm引物、0.2 mm dNTPs、1.5 mm MgCl2和1 U TaqDNA聚合酶。PCR步骤包括94 ℃保温5 min，然后94 ℃保温30 s，56 ℃保温30 s，72 ℃保温30 s，共35个循环。

1.2.3生物信息分析蛋白质空间模拟

Clustal Omega工具用于比对来自不同物种的noggin的氨基酸序列[3]。根据PDB文件1M4U[4]，使用Swiss模型[3]对突变型noggin蛋白的结构进行建模。三维结构的图像由加州大学旧金山分校嵌合体实验室1.8版软件绘制[5]。

1.2.4C2C12体外成骨诱导分化

小鼠成肌纤维细胞系C2C12(ATCC)培养于含10%胎牛血清、1%抗生素的低糖DMEM培养基(Gibco，美国)。0.25%胰酶(Gibco，美国)消化后，以1×104个/孔铺于96孔板过夜。换液后每孔加入100 μL含2%胎牛血清、200 ng/mL BMP-2的成骨诱导分化培养基。随机分为3组：对照组不加noggin抑制成骨分化，实验组分别加入野生型及R167G突变型noggin(50 ng/mL)重组蛋白，成骨诱导分化72 h，4%多聚甲醛室温下固定30 min，水洗3次，按碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行染色。

1.2.5定量PCR

成骨诱导分化72 h后，用Trizol(Thermo，美国)裂解细胞，按说明书分别提取对照组、野生型noggin抑制组、R167G突变型noggin抑制组总RNA。使用Taqman Kit(Applied Biosystems，美国)逆转录为cDNA。以SYBR green扩增ALP、RUNX2、COL1α1，并以GAPDH作为内源对照，在Taqman 7 500(Applied Biosystems，美国)上检测基因表达水平。

2 结果

2.1 Sanger测序结果

一代测序结果显示，患者家系中存在先天性指间关节黏连的患者Ⅲ2、Ⅱ2，在NOG基因上均存在外显子第455位碱基由胞嘧啶(C)突变为鸟嘌呤(G)，导致其编码的第167位氨基酸由精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)。在其他两位无疾病表型的患者Ⅱ1、Ⅲ1中，未发现该位点的突变，在该遗传家系中表现出与疾病共分离。突变致病性预测软件一致预测此突变为致病突变(图2)。

图2 NOG基因Sanger测序结果

2.2 氨基酸序列比对及蛋白质空间结构模拟

为了比较该位点在生物进化过程中的保守性，我们在不同种属间对该位点的一致性进行对比后发现，该位点在智人至斑马鱼中都高度保守，显示了R167位点在保持noggin蛋白正常功能中的重要作用，进一步提示该位点的氨基酸突变可导致疾病的发生。蛋白质空间结构模拟显示，R167位点位于noggin与gdf5结合处，提示该位点的突变可能引起noggin与gdf5结合能力下降，对gdf5抑制作用下降，关节处成骨能力增强，进而出现关节黏连的表型(图3)。

A：种属间氨基酸序列保守性；B：NOG-GDF5蛋白复合体三维空间结构模拟A: Conservation of intergeneric amino acid sequences; B: Three-dimensional spatial structure of noggin-gdf5 protein complex

2.3 C2C12体外成骨诱导分化

C2C12成骨诱导分化3 d后碱性磷酸酶染色结果显示，p.R167G突变后的noggin蛋白对C2C12成骨的抑制作用明显低于野生型noggin蛋白。逆转录定量PCR显示，成骨标志性基因ALP、RUNX2、COL1α1的表达量低于加noggin抑制剂的对照组，但显著高于野生型noggin组。这些结果都提示，R167G突变型noggin的成骨抑制作用减弱，进一步证明了该位点突变的致病性(图4)。

A：碱性磷酸酶染色结果；B：成骨标志性基因定量PCR检测结果A: Results of alkaline phosphatase staining; B: Quantitative PCR detection of osteogenic marker genes

3 讨论

Noggin是最早被发现的BMP功能拮抗剂之一，通过结合和掩蔽位于BMP上的Ⅰ型和Ⅱ型受体位点，与BMP-7相互作用[6]，对软骨形态形成、关节形成[7]以及神经管形成都是必需的[8]。1999年，Gong等[7]通过Sanger测序的方法，首次报道了NOG基因点突变影响人类关节形成。随后，Marcelinod等[9]通过体外表达noggin蛋白，证明了NOG基因突变可能会影响noggin蛋白的分泌、二聚体形成以及与BMP蛋白的结合能力。2005年，Seemann等[10]首次在体外证明了GDF5突变可改变GDF5与受体BMPR1B的结合，引起A2型短指，改变与noggin的结合，可引起关节黏连。

NOG基因突变通常造成近端指间关节屈曲受限和骨性融合。在该家系中，存在PIP关节融合和短指畸形，但没有传导性耳聋及先天性远视等表现，表明了R167G的特异作用机制。

Marcelinod等[9]使用Cos7细胞表达noggin蛋白，证明了NOG基因突变可能会影响noggin蛋白的分泌、与BMP蛋白的结合能力以及二聚体形成。但未通过体外细胞实验探究突变noggin对于成骨分化的影响。研究显示，GDF5突变引起gdf5与noggin结合能力改变，进而产生关节黏连的表型[10-12]。

在该家系中，存在PIP关节融合和短指畸形，家系中患者的特征与SYM1一致。我们发现，该家系中具有关节黏连表现的患者都有p.R167G的点突变，蛋白质空间结构模拟提示该位点位于noggin与gdf5的结合处，体外成骨诱导实验显示p.R167G突变蛋白体对C2C12的成骨抑制作用明显降低。

已有的报道指出，p.R167G突变可导致B2型短指(BDB2)[13]，而尚未报道有先天性指间关节黏连(SYM1)的表现。Lehmann等[13]通过计算机建模noggin-gdf5复合物，并通过计算自由结合能，提出noggin与BMP和GDF的结合能力可能轻微降低。我们基于PDB文件1M4U[4]，使用相同的方法评估BMP7与野生型、R167G noggin之间的相互作用，与Lehmann等的报告一致。根据Fold-X(Beta3 3.0版本)的计算，我们发现突变形式的noggin相较于野生型noggin的结合能力轻度下降。该患者同时存在短指畸形的表现，但NOG基因突变引起短指的机制还未被阐明，有待于进一步的研究。

4 结论

综上所述，我们在该先天性指间关节黏连家系中发现了一个NOG基因杂合性突变c.499C>G p.R167G。该突变与家族中的疾病共分离，在200名正常对照组中缺失。受影响的密码子从智人到斑马鱼都是完全保守的。同一密码子(R167G)的另一个突变将导致BDB2，其特征是手指远端和中部指节发育不全或发育不良。这些结果表明，新的c.499C>T突变是致病的，并且是该家族中SYM1的致病原因。这将为受累家庭提供胚胎植入前诊断(PGD)提供依据。