急性缺血性脑卒中病人血清miR-7和miR-200b表达水平及与脑侧支循环分级的关系探讨

急性缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是指因脑部血液供应突然发生中断引起脑组织软化或坏死的一种急性疾病[1]。流行病学研究表明，我国居民患脑卒中比例为1 114.8/10万人，年发病率为246.8/10万人，死亡率高达46%，给我国人民的生命安全造成巨大威胁[2]。有研究表明，超早期血管再通术通过构建脑侧支循环实现对CIS的有效治疗，脑侧支循环的形成对早期血管介入治疗和病人预后具有一定指导价值[3]。因此，寻找有效预测CIS病人脑侧支循环形成的标志物十分必要。随着分子生物学相关技术进步和研究的开展，血清微小RNA(microRNA，miRNA)等作为标志物应用于疾病的诊断价值日渐受到关注[4]。张家康等[5]报道，脑侧支循环的建立与血管生成密切相关，涉及多种miRNAs参与。本研究通过检测CIS病人血清miR-7、miR-200b水平，旨在分析miR-7、miR-200b与CIS病人侧支循环分级的关系，探讨血清miR-7、miR-200b水平对CIS病人三级侧支循环的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年5月—2018年5月在我院神经内科住院治疗的126例CIS病人为研究对象，根据脑侧支循环的建立情况分为一级侧支循环组、二级侧支循环组和三级侧支循环组。一级侧支循环组44例，男24例，女20例，年龄27～78(61.25±11.74)岁；二级侧支循环组63例，男35例，女28例，年龄30～79(59.43±10.25)岁；三级侧支循环组19例，男12例，女7例，年龄25～76(58.91±10.68)岁。按照数字减影血管造影(DSA)结果对所有受试者的脑侧支循环进行评估，采用美国介入和治疗神经放射学会/介入放射学会(ASITN/SIR)血流分级系统对所有受试者侧支循环的血流代偿程度进行评价[6]。纳入同期来我院体检的健康体检者50名为健康对照组，男28名，女22名，年龄26～77(59.17±10.76)岁。各组研究者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经南阳市中心医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 符合2014年急性缺血性脑卒中诊治指南[7]；均经颅脑MRI或CT检查证实；梗死病灶位于前循环；发病7 d内，住院并经DSA检查确认建立脑侧支循环；资料完整；病人或家属对本研究知情，并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准 病灶对侧大脑或颈动脉存在严重病变；合并冠状动脉粥样硬化致心脏病；合并其他恶性肿瘤；临床资料不完整。

1.3 试剂与仪器 Trizol RNA提取试剂，日本Takara公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix、mirPremier®microRNA Isolation Kit、microRNA qPCR试剂盒，美国Sigma公司；荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；IN-TEGRIS C/V血管机，荷兰Philips公司产品等。

1.4 DSA检查评估侧支循环情况 对CIS病人行数字减影主动脉及脑部全血管造影检查，分别对双侧颈总动脉、双侧锁骨下动脉、颈内动脉和双侧椎动脉行正、侧、斜、汤氏位检查，观察血管情况，对CIS病人脑侧支循环代偿情况进行分级。一级：通过Willis环进行血流代偿；二级：通过软脑膜吻合支、眼动脉及其他较小的侧支及吻合支进行血流代偿；三级：通过新生血管进行血流代偿。

1.5 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测miR-7、miR-200b水平 分别于入院24 h内和体检当日采集CIS病人和健康体检者静脉血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)试管中，4 ℃条件下，以3 000 r/min离心10 min，收集上层血清，提取血清总RNA，之后使用反转录试剂进行操作得到cDNA。以上述cDNA为模板对miR-7、miR-200b进行扩增。本研究采用反应体系：上下游引物分别 0.5 μL，SYBR®Green混合液5 μL，100 ng/μL cDNA 0.5 μL，去离子水3.5 μL，总体积10 μL。按照说明设置反应程序，采用2-△△CT法对miR-7、miR-200b表达情况进行分析。qRT-PCR引物序列见表1，相对表达水平以U6作为内参。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结 果

2.1 CIS组与对照组血清miR-7、miR-200b表达水平比较 与对照组比较，CIS组血清miR-7、miR-200b水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

组别例数miR-7/U6miR-200b/U6对照组501.03±0.181.08±0.15CIS组1260.45±0.110.38±0.09t值25.99737.987P0.0000.000

2.2 血清miR-7、miR-200b水平诊断CIS的临床价值 血清miR-7、miR-200b水平对CIS病人与对照组均具有较强的区分能力。血清miR-7水平对CIS病人诊断的ROC曲线下面积(AUC)为0.734(P<0.001)，以

miR-7/U6≤0.49诊断CIS疾病的灵敏度为63.41%，特异度为75.70%，详见图1A。血清miR-200b水平对CIS病人诊断的AUC为0.667(P<0.001)，以miR-200b/U6≤0.43诊断CIS疾病的灵敏度为57.89%，特异度为74.61%。详见图1B。

图1 血清miR-7、miR-200b水平诊断CIS的ROC曲线

2.3 血清miR-7、miR-200b表达与CIS病人临床指标的关系 不同脑侧支循环分级和不同ASITN/SIR血流分级的CIS病人血清miR-7、miR-200b表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同性别、年龄、高血压和高脂血症CIS病人血清miR-7、miR-200b表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 血清miR-7、miR-200b表达与CIS病人临床指标的关系 单位：例

2.4 不同脑侧支循环分级的CIS病人血清miR-7、miR-200b表达水平比较 与对照组比较，一级侧支循环组、二级侧支循环组和三级侧支循环组CIS病人血清miR-7、miR-200b水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与一级侧支循环组比较，二级侧支循环组和三级侧支循环组CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明显降低(P<0.05)；与二级侧支循环组比较，三级侧支循环组CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明显降低(P<0.05)。详见表4。

组别例数miR-7/U6miR-200b/U6对照组501.03±0.181.08±0.15一级侧支循环组440.55±0.13①0.50±0.11①二级侧支循环组630.42±0.09①②0.36±0.09①②三级侧支循环组190.31±0.07①②0.29±0.06①②

与对照组比较，①P<0.05；与一级侧支循环组比较，②P<0.05；与二级侧支循环组比较，③P<0.05。

2.5 血清miR-7、miR-200b水平对建立三级侧支循环系统CIS病人的预测价值 分析结果表明，血清miR-7水平对建立三级侧支循环系统CIS病人预测的AUC为0.894(P<0.001)，miR-7/U6≤0.32预测建立三级侧支循环系统的灵敏度为79.82%，特异度为86.91%，详见图2A。血清miR-200b水平对建立三级侧支循环系统的CIS病人预测AUC为0.876(P<0.001)，miR-200b/U6≤0.29预测建立三级侧支循环系统的灵敏度为71.90%，特异度为84.73%，详见图2B。

图2 血清miR-7、miR-200b水平对三级侧支循环系统建立的ROC曲线

3 讨 论

CIS是一种突发性脑部疾病，其发病无明显症状，发病速度较快，多发生于45～70岁中老年人[8]。缺血导致血栓形成的部位和大小与脑组织坏死程度有关，疾病发生后，多造成病人言语障碍、智力障碍、活动障碍等，严重者导致死亡[9]，威胁人类身体健康和生命安全。前期建立形成良好的脑侧支循环可显著改善病人梗死情况，脑侧支循环是指脑部动脉供血不足时，血流通过侧支血管或新生血管吻合到达缺血部位，从而使缺血部位得到代偿性灌注。因此，寻找有效评估脑侧支循环情况的生物分子标志物，可为CIS临床治疗方案的制定提供理论支持。

miRNA通过结合靶基因mRNA3′非编码区发挥调节基因表达作用，在多种生理病理过程中具有重要作用[10]。有研究表明，许多miRNA与多种疾病发生有关，如CIS等疾病的发生与miRNA异常表达有关[11]。miRNA一般情况下在细胞内发挥作用，极少穿过细胞膜进入循环系统；当机体处于病理状态时，miRNA可被分泌囊泡或直接分泌至细胞外。进入血液/血清miRNA具有稳定性强的特点，可抵抗体内RNase降解，稳定地存在于血液中且极易被检测[12]。miRNA在不同组织细胞的表达和分布具有较大差异，与机体病理是否发生损伤及损伤类型有关[13]。基于此，血清miRNA有望成为诊断疾病的可能生物标志物，具有一定的应用推广前景。然而，现阶段有关血清miRNA与CIS病人脑侧支循环建立情况的研究较少。

miR-7是一种常见的miRNA。Pollock等[14]研究发现，miR-7在大脑皮层中高表达，阻断miR-7的表达通过上调p53等靶蛋白抑制神经祖细胞生长，促进其凋亡，导致某些脑缺陷，提示miR-7与大脑组织发育相关。Piwecka等[15]研究发现，miR-7等多种miRNA表达异常与神经精神性障碍和大脑功能异常有关。上述研究提示正常情况下miR-7在脑组织中高表达，其表达异常与脑组织相关疾病有关。Li等[16]研究表明，miR-7下调直接靶向血管内皮生长因子(VEGF)的转录激活因子——Kruppel样因子4，从而促进VEGF表达，促进血管生成，提示miR-7是血管类疾病治疗的潜在靶点。脑侧支循环系统的建立实质是新生血管形成的过程，与肿瘤组织侵袭过程中血管生成一致。有研究表明，miR-200b可抑制恶性肿瘤组织侵袭过程中的血管形成，认为作为抑癌因子参与肿瘤的发生[17]。Sinha等[18]研究发现，在多种肿瘤组织中检测到miR-200b表达下调，miR-200b在损伤部位表达下调，可诱导创伤性血管生成，提示miR-200b可作为开关，诱导成人血管生成，但miR-7和miR-200b与CIS病人发病关系不明确。

本研究结果显示，CIS病人血清miR-7、miR-200b表达水平显著低于对照组，表明血清miR-7、miR-200b表达下调可能参与CIS的发病。分析结果显示，血清miR-7水平对CIS病人诊断的AUC是0.734，血清miR-200b水平对CIS病人诊断的AUC是0.667，表明miR-7和miR-200b可区分对照组和CIS病人，提示检测血清miR-7和miR-200b可用于早期筛查CIS疾病，且血清miR-7具有较高的临床应用价值。

根据CIS病人脑侧支循环建立情况分为一级侧支循环、二级侧支循环和三级侧支循环，其中三级侧支循环病人已逐步形成新生血管，血流代偿程度较高，发生出血转化概率较低，病人预后更好，而一级、二级侧支循环病人血流代偿程度较低，治疗重点在于采取手术介入等方法有效促进良好侧支循环的建立[19-20]。因此，准确评估CIS病人侧支循环的建立情况对分辨三级侧支循环CIS病人，制定相应的治疗策略，尽早干预，控制病人病情，改善预后十分重要。本研究结果显示，三级侧支循环组CIS病人血清miR-7、miR-200b水平明显低于一级、二级侧支循环组CIS病人，表明miR-7、miR-200b可能与CIS病人侧支循环建立情况有关。进一步分析发现，血清miR-7、miR-200b水平对三级侧支循环CIS病人和一级、二级侧支循环CIS病人、对照组之间有较强的区分能力，且miR-7/U6≤0.32预测CIS病人三级侧支循环的AUC为0.791，miR-200b/U6≤0.29预测CIS病人三级侧支循环的AUC为0.876，灵敏度及特异度较高，提示检测CIS病人血清miR-7、miR-200b水平对侧支循环建立情况可进行初步预测，且miR-200b预测价值好。

综上所述，CIS病人血清miR-7、miR-200b低表达，且不同分级侧支循环病人存在明显差异，一定程度可预测CIS病人的侧支循环建立情况，推测血清miR-7、miR-200b水平可能用于CIS病人侧支循环情况的预测，为临床制定合理的治疗策略提供参考。