芽孢杆菌Bacillus sp.dwc-2对模拟地下水中U(Ⅵ)的还原行为研究

王 静，刘 军,2，赵长菘，涂 鸿，贺含毅，杨吉军，廖家莉，杨远友,*，刘 宁

(1.四川大学 原子核科学技术研究所，辐射物理及技术教育部重点实验室，四川 成都 610064；2.成都理工大学 核技术与自动化工程学院，四川 成都 610059)

铀是最重要的核能资源之一，具有放射性和化学毒性[1]。铀的主要化学价态为6价，在溶液中的溶解度大，易迁移至生物圈。U(Ⅵ)迁移时会与环境介质中的微生物等发生相互作用，如沉淀、氧化还原等反应[2-5]，当U(Ⅵ)被还原为U(Ⅳ)时，铀的溶解度和迁移率降低，从而减弱铀的迁移。因此关注环境中铀的生物还原行为具有重要意义。

铀的生物还原行为近年来受到广泛重视。梁君等[6]研究发现，丝状真菌黑曲霉还原U(Ⅵ)为U(Ⅳ)，且U(Ⅳ)产物是单核U(Ⅳ)原子紧密包围的轻元素壳组成的形态。Stirling等[7]发现硫酸盐还原菌代谢过程中产生的H2S会参与并促进铀的生物还原；Zhou等[8]的研究表明，Fe(Ⅲ)金属还原菌产生的电子参与了铀的生物还原；Newsome等[9]报道了在乳酸钠和乙酸存在时，U(Ⅵ)从铁还原菌得到电子从而被还原。此外，Ding等[10]发现了芽胞杆菌Bacillussubtilis胞外表面复合物之间斥力抑制铀的还原过程；Zhang等[11]也认为U(Ⅵ)的生物还原受形成的复合体类型的影响。

芽胞杆菌Bacillussp.dwc-2是从中国西南地区某处典型土壤中分离出的一种优势菌。本研究小组[12]曾初步探讨了厌氧条件下Bacillussp.dwc-2还原去离子水中U(Ⅵ)的行为。本文拟在此基础上进一步在厌氧条件下研究Bacillussp.dwc-2对模拟地下水中U(Ⅵ)的还原行为，重点考察时间、地下水中主要无机阴离子、腐殖酸(HA)以及富里酸(FA)对芽孢杆菌还原铀的影响，并通过EDS、SAED、TEM、XPS对还原机制进行初步探讨，以便在接近真实环境条件下了解微生物对U(Ⅵ)的还原行为与机理。

1 实验

1.1 主要试剂与仪器

UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津；ZDX-35BI型座式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；TG16G离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；pHs-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；ZQLY-180GF振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；LSHZ-300型恒温冷冻水浴振荡器，太仓市豪诚实验仪器制造有限公司；DELLIX型真空手套箱，成都德力斯实业有限公司。

1.2 Bacillus sp.dwc-2对U(Ⅵ)的还原

培养分离Bacillussp.dwc-2后，以4 000 r/min离心5 min，然后用0.05 mol/L NaCl溶液洗涤3次，最后将洗净的Bacillussp.dwc-2放入真空手套箱中备用。

将配置好的250 mL UO2(NO3)2·6H2O溶液(U(Ⅵ)溶液)加入500 mL烧杯中，并用0.1 mol/L NaOH或HNO3调节溶液pH值为7.0，再用N2(99.999%)除氧30 min，将处理后的溶液移入500 mL厌氧培养瓶中，放置在真空手套箱内，使氧含量低于1 mg/L，随即加入一定质量的Bacillussp.dwc-2，在恒温振荡器上以150 r/min的转速振荡一定时间，之后以10 000 r/min离心分离，测量上清液中U(Ⅵ)的浓度，下层沉淀物经过冷冻干燥后进行表征。

1.3 材料表征

将冷冻干燥后的下层沉淀物在厌氧手套箱中制作为材料表征用样品。样品在充满氮气的环境中送至检测中心。采用Escalab 250Xi X射线光电子能谱(XPS)仪进行U价态分析；采用透射电子显微镜(TEM)和区域电子衍射(SEAD)分析样品的内部结构。

1.4 数据处理

分析还原反应前后溶液中U(Ⅵ)的含量，按式(1)计算还原率R：

R=(c0-ct-ca)/c0×100%

(1)

其中：c0和ct分别为还原反应前和还原反应进行到t时刻溶液中U(Ⅵ)的浓度，mg/L；ca为Bacillussp.dwc-2吸附的总U(Ⅵ)的浓度，mg/L。通过XPS peak 4.1分峰计算U(Ⅳ)、U(Ⅵ)的面积比，从而计算吸附的U(Ⅵ)和还原的U(Ⅳ)占芽孢杆菌总吸附铀的比值，得到ca和还原的U(Ⅳ)浓度。

2 结果与讨论

2.1 Bacillus sp.dwc-2还原U(Ⅵ)的影响因素

1) 时间

1）做好顶层设计，助推实验室管理制度体系化。设立由单位领导及各相关部门负责人组成的实验室安全管理委员会，按专业类别下设实验室安全专家咨询组，例如：化学、生物、辐射、环境保护、特种设备、职业健康等安全专家咨询组；为委员会评价和审核各项管理制度、安全手册、规范及细则等提供专业性意见或建议，促进实验室管理制度体系化发展。

2) 无机阴离子

图1 时间对Bacillus sp.dwc-2还原U(Ⅵ)的影响Fig.1 Effect of time on U(Ⅵ) reduction by Bacillus sp.dwc-2

表1 无机阴离子对Bacillus sp.dwc-2还原U(Ⅵ)的影响Table 1 Effect of anion on U(Ⅵ) reduction by Bacillus sp.dwc-2

3) 腐殖酸

4) 富里酸

在与腐殖酸因素研究的相同条件下，富里酸(FA)浓度(0～200 mg/L)对Bacillussp.dwc-2还原U(Ⅵ)的影响示于图3。由图3可见，在0～25 mg/L浓度范围内，Bacillussp.dwc-2对U(Ⅵ)的还原率随FA浓度的升高而增加，最大还原率为16.2%。此后继续增大FA浓度，Bacillussp.dwc-2对U(Ⅵ)的还原率有所降低，200 mg/L时还原率只有5.3%。相对于HA，FA对Bacillussp.dwc-2还原U(Ⅵ)的促进作用大，可能是因为HA携带的羧基较FA多，羧基与U(Ⅵ)离子形成新的配合物，配合作用成为主要反应，从而减弱了Bacillussp.dwc-2对U(Ⅵ)的还原。

2.2 还原U(Ⅵ)后的Bacillus sp.dwc-2样品的表征

1) XPS分析

图2 HA浓度对Bacillus sp.dwc-2还原U(Ⅵ)的影响Fig.2 Effect of HA concentration on U(Ⅵ) reduction by Bacillus sp.dwc-2

图3 FA浓度对Bacillus sp.dwc-2还原U(Ⅵ)的影响Fig.3 Effect of FA concentration on U(Ⅵ) reduction by Bacillus sp.dwc-2

图4a、b为U 4f的XPS谱。所有数据均参照文献[10,12，21-22]进行解析处理，分析结果准确。XPS谱中的U 4f7/2U(Ⅵ)和U 4f5/2U(Ⅵ)峰值中心点位于(391.9±0.2) eV和(381.5±0.2) eV，U 4f7/2U(Ⅳ)和U 4f5/2U(Ⅳ)峰值中心点位于(390.8±0.2) eV和(380.1±0.2) eV。已有研究[23]表明，位于381.5 eV处的特征峰是≡SOUO2+，可知羟基(≡SO-)与U(Ⅵ)形成了配合物，表明U(Ⅵ)离子的吸附主要是由于芽孢杆菌表面上羟基的配合作用。上述结果显示芽孢杆菌还原U(Ⅵ)过程中吸附和还原同时存在。

图4 U(Ⅵ)还原后U 4f(a,b)、C 1s(c,d)、O 1s(e,f)的XPS谱Fig.4 XPS pattern of U 4f (a, b), C 1s (c, d), O 1s (e, f) after U(Ⅵ) reduction

由图4a、b可知，不加HA和FA时，最大还原率为12.2%。HA和FA浓度为25 mg/L时，U(Ⅳ)与Bacillussp.dwc-2吸附的总U(Ⅵ)的峰面积比最大，此时还原率最大。最大还原率分别为14.2%和16.2%。HA和FA浓度继续增大，该比值下降，还原率有所下降。

2) TEM-EDS、SAED分析

3 结论

1)Bacillussp.dwc-2对U(Ⅵ)在24 h时达到最大还原率12.2%，HA浓度和FA浓度为25 mg/L时，Bacillussp.dwc-2对U(Ⅵ)的最大还原率分别为14.2%和16.2%。

3) 低浓度的HA和FA在U(Ⅵ)的生物还原中是电子载体，促进U(Ⅵ)的生物还原；随HA和FA浓度的增加，HA、FA在U(Ⅵ)离子表面形成致密的腐殖层，抑制了铀酰离子与菌体间电子的转移，减弱了U(Ⅵ)的还原。相对于FA，HA对U(Ⅵ)的还原影响较弱。

4) TEM-SAED和XPS证实了还原过程中U(Ⅳ)的存在。

上述结果有助于进一步了解真实地下水环境中微生物还原U(Ⅵ)的行为。