硅酸钙基类预混合根管封闭剂生物学性能研究进展*

陈耀忠 潘 洁

根管充填目的是严密封闭根管，防止根管系统内的致病微生物及其代谢产物进入根尖周组织，并促进其病变愈合。根管封闭剂的作用是充填根管壁与固体充填材料(牙胶)之间的间隙，封闭侧副根管、峡部、多个根尖孔及不规则根管系统，包埋残留于根管系统内致病微生物等[1]。因此，根管封闭剂的性能是影响根管治疗成功的重要因素之一。

根管封闭剂按照其主要成分可分为氧化锌丁香油类、氢氧化钙类、玻璃离子类、硅烷类、树脂类及生物陶瓷类根管封闭剂。其中，生物陶瓷类根管封闭剂包括硅酸钙基类、MTA 基类及磷酸钙基类等三大类近十种品牌[1]。iRoot SP(2007 年加拿大Innovative BioCeramix 公司)及EndoSequnce BC封闭剂(2008 年美国Brasseler 公司)是两种化学成分相似的硅酸钙基类预混合根管封闭剂(premixed calcium silicate-based sealers，PCSS)[1-3]，该材料无需调制，可直接注入牙根管内，随取随用，临床使用非常方便；而且具有生物相容性良好、根尖组织耐受、在固化反应中生成羟基磷灰石，可与牙本质形成化学性粘接等优良的生物学性能而受到广泛关注。本文将对其生物相容性、生物活性及抑菌性等生物学性能的研究进展进行综述。

1.生物相容性

在根管充填中，新鲜制备未固化的根管封闭剂可能会超出根尖狭窄处或侧副根管外，与根尖周组织直接接触；另外长期存留在根管系统内固化的根管封闭剂也可释放化学成分到达根尖周组织，对根尖周组织产生影响。因此，根管封闭剂应具有良好的生物相容性，并被根尖周组织所耐受。学者们主要从整体水平、细胞水平及分子水平三个层次对其生物相容性进行研究。

1.1 整体水平 动物实验能全面地反映生物材料作用于机体后的总体情况，与临床实际情况相接近，是在整体水平上对根管封闭剂的生物相容性进行评价。Zhang 等[4]采用大鼠皮下植入及骨埋植实验研究显示iRoot SP 与ProRoot MTA 的组织相容性优于AH Plus(树脂类根管封闭剂，P＜0.05)。Zaki 等[5]建立犬的上颌前磨牙根管治疗模型，组织学研究显示iRoot SP 及Apexit(氢氧化钙类根管封闭剂)等材料在根尖周炎性浸润和矿化评分平均百分比差别无统计学意义(P＞0.05)，均能促进根尖周组织的愈合。上述动物体内植入实验研究结果表明PCSS 具有良好的组织相容性。

1.2 细胞水平 细胞毒性实验是评价牙髓材料细胞相容性最常用的方法之一。学者们主要采用MTT 比色法、流式细胞仪及细胞荧光染色等方法对PCSS 的细胞相容性进行研究，绝大多数研究结果显示与其它类型的封闭剂相比，其具有良好的细胞相容性[6-21]。例如Zoufan 等[8]采用MTT 比色法研究显示：新鲜制备及固化的EndoSequence BC浸提液对小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒性与GuttaFlow(硅烷类根管封闭剂)相似(P＞0.05)，显著小于AH Plus Jet(AH Plus 注射装)及Tubli-Seal Xpress(氧化锌丁香油类根管封闭剂)(P＜0.05)。Zhou 等[12]采用扫描电镜(SEM)观察人牙龈细胞在固化的EndoSequence BC 及AH Plus 样品表面附着生长，但在MTA Fillapex(MTA 基类类根管封闭剂)样品表面几乎没有细胞附着。与上述研究结果相一致，PCSS 对MG63 成骨肉瘤细胞[6]、人牙周膜细胞[9]、小鼠三叉神经节神经元细胞[18]及人骨髓间充质干细胞[20]等具有良好的细胞相容性。但也有不一致的研究结果，如Loushine 等[7]采用MTT 比色法研究显示EndoSequnce BC 对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1 cells)的毒性大于AH Plus(P＜0.05)，但随着固化时间的延长，其细胞毒性逐渐减小。PCSS 细胞相容性研究结果的不一致可能与实验情况差异有关，包括使用的细胞系、研究材料呈递给细胞的方式等相关。

近年来，学者们模拟根管封闭剂在临床体内环境，建立了三维的细胞培养体系，对PCSS 细胞相容性进行了研究。与传统的二维细胞培养模型相比，三维模型中细胞行为更典型、稳定性更高、寿命更长，因而更具有生理学相关性[16]。Silva 等[16]通过建立二维及三维Balb/c 3T3 细胞培养模型研究显示在AH Plus、MTA Fillapex 等五种根管封闭剂中，EndoSequence BC 的细胞毒性最低，MTA Fillapex 的细胞毒性最大(P＜0.05)。da Silva 等[17]建立根管充填模型及三维Balb/c 3T3 细胞培养模型研究显示：EndoSequnce BC、EndoSeal(硅酸钙基类封闭剂)及AH Plus 组与阴性对照组相似(P＞0.05)，无明显细胞毒性，而MTA Fillapex 细胞毒性大(P＜0.05)。

1.3 分子水平 遗传毒性是根管封闭剂对细胞遗传物质的作用，可能影响其完整性，是致癌性最重要的指标之一[22]。Candeiro 等[14]采用微核试验对比研究显示EndoSequnce BC 浸提液组的人牙龈成纤维细胞出现微核百分数细胞与阴性对照组相似(P＞0.05)，显著少于AH Plus(P＜0.05)。Nair 等[21]也通过微核实验研究显示iRoot SP 及EndoSequence BC 对L929 细胞的遗传毒性显著小于Tubli-seal(氧化锌丁香油类封闭剂)(P＜0.05)。Eldeniz 等[13]通过γ-H2AX 识别抗体免疫荧光法测定研究iRoot SP、AH plus 等9 种封闭剂对慢病毒基因转染人类端粒酶逆转录酶的牙周膜细胞DNA 双链断裂影响，结果显示iRoot SP 遗传毒性小。上述研究说明PCSS 具有很小的遗传毒性，致癌性小。

另外，da Silva 等[17]采用酶联免疫吸附测定(ELISA)研究显示EndoSequnce BC 不会促进Balb/c 3T3 的炎症细胞因子如IL-1β 和IL-6 释放，提示其可能不会促进根尖组织的炎症。Ruparel 等[23]通过放射免疫测定法检测显示EndoSequnce BC 降低了大鼠三叉神经感觉神经元释放降钙素基因相关多肽(CGRP)，说明其可能不会加重患者的术后疼痛反应。

目前对PCSS 生物相容性研究以细胞毒性研究为主，但分子水平特别是基因水平等相关方面的研究较为缺乏。

2.生物活性

生物活性是理想根管封闭剂应具有的性能之一。如果根管封闭剂具有生物活性，它将通过沉积在其表面的羟基磷灰石与牙本质形成稳定的粘合，提高其粘结强度[24,25]。生物活性是硅酸钙基类材料重要特点之一，相关研究显示PCSS 具有体外生成磷灰石类材料的性能，如Carvalho 等[24]研究显示充填了EndoSequnce BC 的根管样品经模拟体液浸泡30d，在其与牙本质交界部位、牙本质内表面均有碳酸钙晶体沉积。Han 等[26]研究显示充填有EndoSequnce BC 等三种生物陶瓷类材料的根管样品经不含钙、磷的磷酸缓冲盐溶液浸泡后，材料表面有钙/磷比为1.6∶2.0 的针状或叶状的矿化物生成。

检测生物材料在模拟体液浸泡后生成磷灰石材料可预测其在体内骨的生物活性，但这种方法还缺乏足够的科学证据，例如SiO2，TiO2，ZrO2，Nb2O5和Ta2O5等金属氧化物浸入模拟体液后具有体外生物活性，但在体内未能证实这些材料与骨结合的能力[27]。因此学者们研究了PCSS 的成骨诱导性能，如Güven 等[10]研究显示MTA 和iRoot SP 能显著促进了人牙胚干细胞Ⅰ型胶原(COL1A)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)的mRNA 上调表达(P＜0.05)，说明这两种材料能诱导人牙胚干细胞分化为成牙本质细胞样细胞，但MTA 能提供更多的诱导电位和硬组织沉积。Chang 等[11]研究显示iRoot SP 能增加人牙周膜细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和矿化结节的形成，并促进OCN、OPN 等成骨相关的mRNA 上调表达，显示出良好的成骨潜能。Zhang 等[6]采用qRT-PCR 及酶联免疫吸附技术研究显示iRoot SP 能促进3d 和6d 组人成骨肉瘤MG63 细胞的Ⅰ型胶原、骨钙素和骨涎蛋白等与矿化相关的mRNA上调表达；6d 组的Ⅰ型胶原及骨钙素等蛋白表达增加，说明iRoot SP 有促进成骨分化及矿化作用。因此，PCSS 具有一定的生物活性。

3.抑菌性能

根管治疗能有效减少感染根管内的致病微生物，但由于根管系统的复杂性，一般难以清除所有微生物，残留的微生物通常以生物膜的形式存留在牙本质小管、根管峡部和侧副管中。因此，应用具有抑菌性能的根管密封剂有利于减少剩余微生物的数量或甚至根除感染。目前，学者们主要采用琼脂糖扩散、直接接触法及牙本质感染定量模型等方法对PCSS 的抑菌性能进行了研究，研究结果显示其具有一定的抑菌性能[9,14,28-36]。

琼脂糖扩散及直接接触法是检测根管封闭剂的抑菌性能最为常用的两种方法，如Singh 等[33]采用琼脂糖扩散抑菌实验研究显示EndoSequnce BC 对粪肠球菌的抑菌环为14.4±1.497mm，说明其有较强的抑制粪肠球菌的性能。Zhang 等[28]采用改良的直接接触法研究显示iRoot SP、AH Plus 及EndoRez等根管封闭剂对粪肠球菌有抑制作用，但材料的抑菌性能随着固化时间的延长逐渐减弱。Ozcan 等[29]采用直接接触法研究显示新鲜制备的iRoot SP 与MTA Fillapex 对白色念珠菌有抑制作用，但固化1d 及7d 组的材料无抑制作用。琼脂糖扩散法操作简单、灵活，但其实验结果会受到材料溶解性及扩散性能的影响，不一定能反映根管封闭剂的真正抑菌潜能；而直接接触法不受研究材料溶解性及扩散性影响，实验结果更加准确，因而更适合于检测根管封闭剂等不溶材料的抑菌性能[35]。上述这两种方法的研究结果表明PCSS 具有一定的抑菌作用，且其抑菌性能与其固化状况相关。

琼脂扩散实验及直接接触实验只能检测根管封闭剂对游离培养的微生物的抑菌作用，而Ma 等[36]通过将粪肠球菌混悬液离心的方法建立了一种标准化的牙本质感染定量模型，可用于检测根管封闭剂对生物膜和感染牙本质中微生物的抑制作用。Wang等[30]采用新型牙本质感染模型研究显示：与AH Plus 一致，EndoSequnce BC 对牙本质小管中的粪肠球菌具有显著的抗菌作用，且封闭剂与感染牙本质接触时间越长，抑菌效果越佳，差别有统计学意义(P＜0.05)。Du 等[31]采用牙本质感染模型进一步研究显示AH plus、EndoSequnce BC 组等与次氯酸钠(NaClO)联合使用对粪肠球菌的抑菌效果要优于单纯封闭剂组及单纯次氯酸钠组(P＜0.05)，具有协同作用。PCSS 牙本质感染定量模型的研究结果与直接接触法并不完全一致，其持久的抑菌性能可能与硅酸钙/磷酸盐引起的生物矿化以及牙本质矿物参与相关[30,31]。

与上述PCSS 抑菌性能研究结果并不完全一致，Shin 等[34]研究显示EndoSequnce BC 封闭剂的PBS 浸提液对牙髓卟啉菌及牙龈卟啉菌的抑制作用弱；Willershausen 等[9]研究显示EndoSequence BC 不能抑制粪肠球菌、微小微单胞菌在其表面粘附生长，说明其无抑菌作用。

PCSS 抑菌性研究结果显示其具有一定的抑菌性能，但不同的研究方法结果存在争议。目前的研究对象多为游离菌或单一细菌的生物膜，但在临床根管感染中存在的是含有不同细菌的混合生物膜，因此PCSS 对混合菌生物膜的抑菌性能还需进一步研究。

4.生物学性能的机理

PCSS 良好的生物学性能可能与其材料成分及其固化后的产物相关。PCSS 的主要成分为硅酸三钙、硅酸二钙、磷酸氢钙、氢氧化钙、氧化锆、填料以及不含水的增稠剂预混合而成[2,3,37]。当PCSS充填于根管内，硅酸三钙、硅酸二钙可吸收根管内或牙本质小管内残留的水分而引发水化反应生产硅酸钙水合物凝胶和氢氧化钙(见化学反应式1,2)；氢氧化钙与磷酸根离子反应沉淀羟基磷灰石和水(见化学反应式3)；生成的水使得水化反应循环继续[25,37]。

新鲜制备的PCSS 在水化反应中生成强碱性的氢氧化钙，其pH 值很高，可导致相邻细胞和中等蛋白质变性，产生轻微细胞毒性作用；但氢氧化钙又能通过损伤细菌膜或DNA、使蛋白质变性等对粪肠球菌等革兰氏阴性菌具有杀菌作用[2,28,38]。因此，在很多的相关研究显示新鲜制备的PCSS 会出现较强的抑菌性能及一定的细胞毒性。但随着材料的固化反应的进行，氢氧化钙与磷酸根离子反应生成羟基磷灰石，其pH 逐渐降低，细胞损伤逐渐消退，抑菌性能也减弱。羟基磷灰石是人体硬组织主要组成成分，不仅具有良好的生物相容性，而且可能有助于增加细胞矿化基因表达并起到钙化激活剂的作用，促进细胞的成骨分化，因而PCSS 具有一定的生物活性[1,6,39,40]。另外，PCSS 水的接触角小，呈亲水性，因此该类材料易于渗入牙本质小管内，使得该材料能与牙本质小管内的微生物生物膜直接接触，提高其抑菌性能，并通过羟基磷灰石的沉积与牙本质形成稳定的粘合，提高与牙本质的粘合强度及封闭性能[25]。

5.总结与展望

综上所述，PCSS 具有良好的生物相容性、生物活性及抑菌性能，临床应用前景良好，但其生物学性能的研究如分子生物相容性、混合菌生物膜的抑菌性能等还有待于进一步深入研究。