MCUR1表达对卵巢癌细胞生长的影响及作用机制

白翔宇曹珊珊杨世荣高天陈艳琴鲍登克

作者单位：475004开封 1河南大学药学院；710032西安 2空军军医大学唐都医院普外科；3空军军医大学西京医院妇产科；716000延安 4延安大学医学院

卵巢癌是女性发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，全世界范围内每年新发病例近239 000例，而相关死亡病例152 000例［1-2］。卵巢癌临床症状隐匿，早期难以发现，且易发生转移，侵袭性强，但临床上尚缺乏特异性的诊断方法，70%以上的患者确诊时已为晚期［3］，5年生存率低于30%［4-5］。因此亟待开发可用于卵巢癌诊断及治疗的靶点。

线粒体作为“能量工厂”为细胞提供能量，Ca2+作为细胞内第二信使在细胞内传递信号，两者都在细胞生命活动中扮演重要的角色。线粒体钙单向转运体调节因子1（mitochondrial calcium uniporter regulator 1，MCUR1）是细胞内的钙调节分子，在调控线粒体钙稳态方面发挥至关重要的作用［6-7］。而线粒体钙稳态可决定细胞氧化呼吸功能进程、细胞生死、活性氧生成、线粒体ATP生成、细胞质内的钙信号及胞浆钙环境维持等，目前研究发现线粒体钙稳态异常与多种肿瘤的发生和发展紧密相关，且MCUR1在其中起重要作用［8-9］。本研究首先利用TCGA（the Cancer Genome Atlas）数据库分析卵巢癌组织中MCUR1的表达水平与患者预后的关系，然后进一步收集组织标本及在细胞水平和动物实验中观察MCUR1对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响，并初步探讨MCUR1发挥作用的分子机制，以期为卵巢癌诊断和治疗寻找的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 TCGA数据库 在TCGA数据库中筛选卵巢癌患者数据集，采用R语言（3.1.1版本）软件进行统计分析。共下载372例卵巢癌患者数据，年龄为30～87岁，均有总生存期（overall survival，OS）和RNA seq数据，OS定义为诊断日期至死亡或者失访的时间。

1.1.2 组织样本来源 纳入43例卵巢癌组织石蜡切片，均购自空军军医大学西京医院病理科，组织样本于2017年2月至2019年2月由空军军医大学西京医院收集，所有患者具有完整临床资料并签署知情同意书，本研究已通过空军军医大学西京医院医学伦理委员会批准。

1.1.3 细胞株与裸鼠 人卵巢癌细胞系A2780购自武汉普诺赛公司；4～6周雌性BALB/c-nu裸鼠购自空军军医大学动物实验中心，饲养于无菌条件下，12 h明暗周期，水和食物充足。动物实验按照空军军医大学动物伦理委员会批准的规程进行。

1.2 主要试剂

新生胎牛血清、RPMI1640培养基购自Hyclone公司；LipofectamineTM2000、引物购自Invitrogen公司；MCUR1干扰片段和过表达质粒购自上海吉玛公司；real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司；免疫组化试剂盒、DAB显色液购自福州迈新试剂公司；MCUR1抗体购自Sigma-Aldrich公司；p53抗体购自Cell Signaling Technology公司；Caspase-3抗体、Bax抗体、Bcl2抗体、Cyclin D1抗体、Cyclin E抗体购自Abcam公司；β-actin抗体购自北京天德悦公司；MTS试剂盒购自Promega公司。

1.3 免疫组织化学法检测卵巢癌组织中蛋白的表达水平

免疫组化染色采用SP法，即脱蜡水化、抗原修复、封闭内源性过氧化物酶、山羊血清封闭，滴加对应一抗过夜，第2天滴加生物素标记的二抗、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶三抗孵育，用新鲜配置的DAB工作液显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，镜下观察。结果判读采用IRS表示，IRS为每个样本中的染色强度值（0分：无染色；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：强染色）和阳性细胞百分比值（0分：＜10%；1分：10%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%）的乘积，IRS＞3为阳性，IRS≤3为阴性。

1.4 细胞培养和转染

A2780细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养于37℃、5% CO2细胞培养箱中，取适量对数生长期细胞接种于6孔培养板，24 h后细胞培养板覆盖率为70%～80%时进行转染。转染试剂采用LipofectamineTM2000，用瞬时转染法分别将MCUR1干扰片段及过表达质粒转染A2780细胞，标记为siMCUR1组和MCUR1组，并分别设置相应的阴性对照，标记为siCtrl组和EV组。

1.5 qRT-PCR实验检测卵巢癌细胞中MCUR1 mRNA的表达情况

按总RNA提取试剂盒操作方法提取瞬时转染后的卵巢癌细胞总mRNA，OneDrop检测RNA纯度和浓度，反转录为cDNA后进行qRT-PCR实验。MCUR1上游引物：5'-AACTCTACTTCGACACTCATGCCTTAG-3'，下游引物：5'-GCCTCCAGGATCTTGACCAATGC-3'；GAPDH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反应体系为25μL，反应条件设置为95℃30 s；95℃5 s、55℃30 s、72℃30 s，40个循环；72℃1 min。每个样品设置3个复孔，采用2-△△Ct法计算基因相对表达量，实验重复3次。

1.6 Western blot实验检测卵巢癌细胞中增殖和凋亡相关蛋白的表达水平

收集转染48 h后的A2780细胞，PBS洗涤3遍，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min，4℃12 000 r/min离心30 min，收集上清液。BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10 min使其变性。按每孔40μg上样，蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加一抗4℃孵育过夜。用1×TBST洗膜3次，每次5 min。加二抗室温孵育1 h。用1×TBST洗膜3次，每次5 min。采用ECL化学发光液显影分析。

1.7 MTS法检测干预MCUR1后卵巢癌细胞的生长情况

取对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为100μL/孔，加入96孔板，2×103/孔；5% CO2、37℃孵育24 h，显微镜观察；每孔加入20μL MTS溶液（5 mg/mL），培养2 h后，使用酶标仪在490 nm波长处检测细胞吸光度值。每组采用5个复孔，实验重复3次。

1.8 克隆形成实验检测干预MCUR1后卵巢癌细胞的增殖能力

取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，将细胞悬液梯度稀释接种于6孔板，1 000/孔，置于培养箱静置培养3周，中间更换2次培养基，当板中出现细胞克隆团时，弃去上清，PBS洗涤，用4%多聚甲醛于室温下固定细胞30 min。弃去固定液，加适量结晶紫染色液染色10 min，将平板克隆进行拍照，计数克隆细胞数。

1.9 裸鼠皮下成瘤实验

将裸鼠按接种细胞随机分为4组，分别标记为siMCUR1组、siCtrl组、MCUR1组和EV组，打上耳标，每组7只，观察2 d若状况均良好，即接种细胞。取对数生长期细胞，2.5%胰酶消化后，加PBS制备成细胞悬液，细胞密度为1×107/mL。于裸鼠右侧肩胛下部皮下注射200μL细胞悬液，形成隆起皮丘后拔出注射器，再次消毒局部皮肤。1周后开始观察皮下肿瘤形成情况，并用游标卡尺测量皮下肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，每隔2 d测量1次。5周后处死裸鼠，取出瘤体并称重。肿瘤组织切至黄豆大小，用福尔马林常规固定，脱水，至透明，石蜡包埋，制成0.3μm切片。

1.10 组织TUNEL实验检测细胞凋亡情况

石蜡切片脱蜡水化后，加蛋白酶K孵育20 min，1×PBS洗涤3遍；加TUNEL反应液，37℃避光孵育1 h，1×PBS洗涤3遍；DAPI染色，封片，荧光显微镜拍照。将DAPI和TUNEL均呈阳性的细胞记为凋亡细胞，每块组织于40倍目镜下拍摄5个视野，统计细胞阳性率。

1.11 统计学方法

采用SPSS 21.0软件和GraphPad Prism 7.0软件对实验数据进行统计分析。计量数据采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用百分比表示。对TCGA数据进行分析，采用Kaplan-Meier法计算生存率，根据MCUR1 mRMA表达量的中位数将患者分为低表达组和高表达组，两组间生存曲线的比较采用Log-rank检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCUR1在卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系

根据MCUR1 mRNA表达水平中位数（9.95）进行分组，低于中位数的样本为低表达组，共203例；高于中位数的样本为高表达组，共169例。对372例卵巢癌患者进行Kaplan-Meier生存分析，MCUR1高表达组中位生存期为53.7个月，低表达组中位生存期为41.3个月，两组比较差异有统计学意义（P=0.003），见图1A；43例卵巢癌标本进行免疫组织化学法染色，MCUR1阳性率为25.6%（11/43），见图1B。

图1 MCUR1在卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系Fig.1 Expression of MCUR1 in ovarian cancer tissues and its relationship with prognosis

2.2 MCUR1的转染效果

在卵巢癌A2780细胞中，与siCtrl组相比，siMCUR1组细胞中MCUR1的mRNA和蛋白表达量均显著下降（P＜0.01）；MCUR1组细胞中MCUR1的mRNA和蛋白表达量均较EV组显著升高（P＜0.01）。见图2。

图2 MCUR1在卵巢癌细胞系中的表达Fig.2 Expression of MCUR1 in ovarian cancer cell lines

2.3 MCUR1对卵巢癌细胞生长的影响

MTS实验检测结果显示，转染96 h后，siCtrl组和siMCUR1组相对应的OD值分别1.14±0.02和2.47±0.03，差异有统计学意义（P=0.004）；MCUR1组和EV组OD值分别为1.06±0.05和1.61±0.04，差异亦有统计学意义（P=0.032），见图3A；克隆形成实验检测结果显示，siCtrl组和siMCUR1组细胞克隆形成数分别为（113±27）个和（245±31）个，差异有统计学意义（P=0.006）；MCUR1组和EV组细胞克隆形成数分别为（46±11）个和（107±23）个，差异有统计学意义（P=0.004），见图3B。

图3 MCUR1对卵巢癌细胞增殖的影响Fig.3 Effect of MCUR1 on the proliferation of ovarian cancer cells

2.4 MCUR1对裸鼠皮下移植瘤生长的影响

裸鼠皮下移植肿瘤模型实验结果显示，接种31 d后，siMCUR1组和siCtrl组的肿瘤体积分别为（1 450±37）mm3和（347±51）mm3，肿瘤重量分别为（1.37±0.21）g和（0.42±0.13）g，差异均有统计学意义（P=0.006，P=0.004），见图4A。MCUR1组和EV组的肿瘤体积分别为（271±53）mm3和（1 230±90）mm3，肿瘤重量分别为（0.29±0.15）g和（1.18±0.17）g，差异亦均有统计学意义（P=0.005，P=0.004），见图4B。

裸鼠皮下移植瘤组织切片的HE染色、免疫组化染色结果显示，siMCUR1组的Ki67阳性率高于siCtrl组［（79.46±1.33）% vs（42.75±1.28）%，P=0.007］，见图5A；MCUR1组的Ki67阳性率低于EV组［（19.73±1.45）%vs（53.20±1.19）%，P=0.004］，见图5B。TUNEL实验结果显示，siMCUR1组的细胞凋亡率较siCtrl组降低［（1.73±0.53）% vs（3.72±0.66）%，P=0.023］，见图5C；MCUR1组细胞凋亡率较EV组上升［（13.41±1.21）% vs（6.43±0.44）%，P=0.041］，见图5D。

图4 MCUR1对裸鼠皮下成瘤的影响Fig.4 Effect of MCUR1 on subcutaneous tumorigenesis in nude mice

图5 MCUR1对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响Fig.5 Effect of MCUR1 on proliferation and apoptosis of ovarian cancer

2.5 MCUR1对增殖和凋亡相关分子蛋白表达的影响

Western blot实验检测结果显示，siMCUR1组相较于siCtrl组细胞，p53、Caspase-3和Bax表达下调，而Bcl2、Cyclin D1和Cyclin E表达上调；MCUR1组相较于EV组，p53、Caspase-3和Bax表达上调，Bcl2、Cyclin D1和Cyclin E表达下调，见图6。

图6 MCUR1对增殖和凋亡相关分子蛋白表达的影响Fig.6 Effect of MCUR1 on protein expression of proliferation-and apoptosis-related molecules

3 讨论

线粒体作为细胞中的主要能量来源细胞器，通过线粒体生物发生、代谢重编程、氧化应激信号通路参与肿瘤细胞生长、生存和转移，与肿瘤恶性进展密切相关［10-11］。Ca2+是细胞内第二信使，可调节基因转录和细胞增殖、迁移和死亡［12］。线粒体代谢功能和Ca2+稳态作为细胞生命活动的重要调控环节，两者密切相关，共同维持细胞生命活动进程［13-14］。1967年CORTASSA等发现，离体线粒体内能大量累积游离Ca2+，后续研究进一步证实线粒体是细胞主要的钙储存场所之一［15］。MCUR1于2012年被MALLILANKARAMAN等通过靶向RNAi技术筛查得到，定位于线粒体内膜上［7］。该研究还报道MCUR1可与线粒体Ca2+单向转运体（MCU）、线粒体钙摄取分子1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）、MICU2形成复合体，调节线粒体Ca2+转运［16］。但细胞内MCUR1的缺失会导致线粒体Ca2+浓度显著降低（约85%），过表达MCUR1不仅能正向调节MCU的Ca2+摄取效率，显著促进线粒体Ca2+内流，同时也可提高线粒体对胞浆钙离子的缓冲能力。值得一提的是，尽管MCUR1功能的发挥依赖于MCU，但当MCUR1表达缺失，MCU则无法维持正常线粒体Ca2+水平，由此可见MCUR1的表达与功能的发挥是调节线粒体钙稳态的关键［7］。此外，MCUR1在细胞正常生命活动和各种疾病发生发展中起重要作用［17］。MALLILANKARAMAN等［7］发现，HeLa细胞中敲除MCUR1后可阻碍细胞氧化磷酸化过程，导致细胞三磷酸腺苷合成减少及其依赖的蛋白激酶活性降低，最终引起细胞自噬。TOMAR等［18］发现血管内皮细胞敲除MCU及MCUR1后，线粒体生物合成减弱，细胞增殖速度减缓、迁移能力减弱，同时可诱发细胞自噬。REN等［19］发现MCUR1在肝细胞癌中表达显著升高，且MCUR1高表达的患者预后较差，MCUR1升高还会使线粒体对Ca2+的摄取加强，同时抑制线粒体依赖性的细胞凋亡，促进细胞增殖。以上研究说明MCUR1是维持细胞正常生命活动的关键分子，MCUR1异常表达可能通过损害线粒体功能和改变细胞钙稳态损害细胞生长。为了解MCUR1与卵巢癌的关系，本研究首先下载并分析TCGA数据库中有关数据，结果发现MCUR1表达水平越高的卵巢癌患者预后较好，由此初步推测MCUR1可能与卵巢癌密切相关。

随后本研究收集组织标本进行验证，免疫组织化学法检测发现大多数卵巢癌样本MCUR1染色为阴性，MCUR1阳性率仅为25.6%。进一步构建干涉和过表达MCUR1卵巢癌细胞系，通过细胞增殖及构建裸鼠成瘤模型等观察MCUR1表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响，发现干涉MCUR1表达后，卵巢癌细胞增殖能力明显增强，裸鼠皮下荷瘤生长速度亦加快，Ki67表达升高，而细胞凋亡能力减弱，说明干涉MCUR1可明显促进卵巢癌细胞生长；反之过表达MCUR1则抑制了卵巢癌细胞及裸鼠皮下移植瘤生长。在分子机制方面，本研究发现过表达MCUR1后，p53蛋白表达升高，p53下游凋亡关键分子Caspase-3和Bax表达升高，而Bcl2表达则降低，周期关键分子Cyclin D1和Cyclin E表达亦降低，提示MCUR1抑制卵巢癌细胞生长可能通过激活p53通路，从而促进线粒体介导细胞凋亡和抑制细胞增殖实现。

本研究结果表明，MCUR1在卵巢癌组织中的阳性表达率较低，而在卵巢癌细胞中干涉MCUR1可抑制卵巢癌细胞增殖，促进细胞凋亡，且可能通过激活p53通路实现。MCUR1可能作为一个抑癌基因，有望为卵巢癌的诊断及治疗提供新思路。未来本课题组将收集更多样本并在多个细胞系重复上述实验，进一步深入研究MCUR1参与卵巢癌恶性进展的机制。