α受体介导的雌二醇对大鼠结肠平滑肌细胞RhoA/ROCK 通路的影响

姜 玲，汤玉蓉，熊文婕，俞 汀，郑永娉，沈小雪，林 琳

南京医科大学第一附属医院消化科，江苏 南京 210029

慢性便秘（chronic constipation，CC）是全球范围内常见的胃肠功能障碍性疾病，严重影响人们身心健康和生活质量，成为多种心脑血管病变致残致死的诱因［1］。最新数据显示，我国8.2%的人群受便秘困扰（约1亿人）［2］，男女比例约为1∶2.3［3］，育龄期和妊娠期妇女发病率更高［4］。动物实验发现雌激素可抑制大鼠结肠运动，致便秘发生［5-6］。然而，雌激素抑制结肠平滑肌（smooth muscle cell，SMC）收缩的机制尚未完全明确。

肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化水平是决定平滑肌收缩程度的关键因素。MLC 磷酸化水平受钙离子/钙调蛋白依赖的肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和钙离子非依赖的肌球蛋白磷酸酶（MLCP）的双重调节［7］。RhoA/ROCK 通路是调控MLCP 活性的主要通路之一（钙敏化机制）［8-10］。活化后的ROCK 主要通过2 条途径抑制MLCP 活性：其一是通过磷酸化MLCP 的调节亚单位MYPT1，使其失去催化MLC脱磷酸化的能力，细胞质内磷酸化MLC 水平提升，使平滑肌收缩；其二是通过磷酸化一种平滑肌特异性磷蛋白CPI⁃17，使其发生一系列构象改变而抑制MLCP 活性［11-12］。研究发现雌激素可抑制冠脉、膀胱、尿道、血管等平滑肌RhoA/ROCK 表达［13-15］。因此，本研究旨在从细胞水平探讨17β⁃雌二醇（17β⁃estraiol，，E2）对大鼠结肠平滑肌上RhoA/ROCK通路的影响，为治疗雌激素相关性便秘等胃肠动力障碍提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级雌性Sprague⁃Dawley（SD）大鼠，10 日龄［南京医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（苏）2016⁃000］。DMEM 培养液、青霉素⁃庆大霉素双抗（Hyclone 公司，美国），胎牛血清、Ⅱ型胶原酶（Gibco公司，美国），E2、牛血清白蛋白（BSA）结合的E2（BSA⁃E2）、雌激素受体阻断剂ICI182780、雌激素受体α（ERα）选择性激动剂PPT、雌激素受体β（ERβ）选择性激动剂DPN（Sigma 公司，美国），ROCK 抑制剂Y27632（Selleck 公司，美国），RhoA、ROCK1、α⁃肌动蛋白（α⁃SMA）抗体（Abcam 公司，美国），p⁃MYPT1、p⁃CPI17、p⁃MLC、β⁃actin抗体（CST公司，美国），ERα、ERβ抗体（Santa Cruz 公司，美国），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、DAPI、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天公司），Cy3 标记山羊抗兔IgG 二抗、FITC 标记山羊抗小鼠IgG 二抗（Bioworld公司，美国），Super ECL 化学发光试剂盒（Thermo 公司，美国），试剂盒（TaKaRa公司，日本）。

细胞培养箱（Thermo 公司，美国），酶标仪（Mo⁃lecular Devices 公司，美国），蛋白电泳及转膜系统（Bio⁃Rad 公司，美国），凝胶成像分析系统（GE Healthcare公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠结肠SMC的分离及培养

将出生12～15 d SD 雌性大鼠断颈处死，自肛门上2 cm取结肠5～7 cm左右，以PBS缓冲液快速反复冲洗，去除黏膜层和浆膜层，剪碎平滑肌组织，加入10%Ⅱ型胶原酶消化液，吹打消化5 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清反复重悬离心3 次，用含10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化并重悬细胞、过筛，接种于培养皿，于37 ℃、5%CO2条件下培养，细胞隔天换液。

待SMC长至致密单层时，以PBS冲洗，0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，加入同体积含10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化。收集全部细胞吸入15 mL 离心管，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，以1∶2～1∶4 比例接种于同体积培养皿中。

1.2.2 对结肠SMC 进行ROCK1/ERα与α⁃SMA 免疫双标

取对数生长期的SMC，0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种至激光共聚焦培养皿中，于CO2培养箱培养1～3 d，待SMC长至单层时，吸去培养液，以PBS洗1次，加100%冰丙酮固定10 min，PBS 冲洗3 次，每次10 min，加10%山羊血清封闭1 h，然后吸去山羊血清，分别加α⁃SMA 一抗（小鼠1∶100）和ROCK1 一抗（兔1∶100），或α⁃SMA 一抗（兔1∶100）和ERα一抗（小鼠1∶50），阴性对照不加一抗，4 ℃过夜；PBS 冲洗3 次，每次10 min，避光，加Cy3 标记山羊抗兔IgG 二抗（1∶100）和FITC 标记山羊抗小鼠IgG二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次，每次10 min；DAPI染核10 min，PBS冲洗3次，每次10 min，镜下观察特异性荧光。α⁃SMA 用于鉴定培养的结肠SMC［16］。

1.2.3 SMC干预

取第2～3 代SMC，PBS 冲洗、加无血清的DMEM培养液饥饿12 h。采用随机数字表法进行随机分组：E2不同浓度组（0、10、50、100 nmol/L，24 h）；E2 不同时间组（0、6、12、24、48 h）；Western blot 和实时荧光定量（qRT）⁃PCR 检测SMC 中RhoA、ROCK1 蛋白和mRNA表达水平，根据得出的E2最适浓度及时间进行以下实验：ROCK 抑制剂Y27632 不同浓度组（1、5、10、25、50 μmol/L）：Y27632 预处理1 h 后，加含50 nmol/L E2 的无血清培养液；溶剂对照组（C 组）：含2 μL DMSO 的无血清培养液；E2 组：含50 nmol/L E2的无血清培养液；PPT组：含1 μmol/L PPT的无血清培养液；DPN 组：含1 μmol/L DPN 的无血清培养液；ICI182780组：1 μmol/L ICI182780预处理1 h 后，加含50 nmol/L E2 的无血清培养液；BSA⁃E2 组：含50 nmol/L BSA⁃E2 的无血清培养液；干预24 h，用于下面的实验。溶剂DMSO 的终浓度均不超过1‰。以上实验各重复3次。

1.2.4 Western blot 检测SMC 中RhoA/ROCK 通路中蛋白表达

RIPA 裂解液裂解细胞，提取各组细胞蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。每泳道加入40～60 μg 蛋白样品，行SDS⁃PAGE 凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，分别加入RhoA 抗体（1∶1 000）、ROCK1 抗体（1∶1 000）、p⁃MYPT1 抗体（1∶1 000）、p⁃CPI17 抗体（1∶1 000）、p⁃MLC 抗体（1∶1 000）、β⁃actin 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，ECL显影，凝胶成像系统拍照、分析。以β⁃actin为内参。

1.2.5 实时荧光定量（qRT）⁃PCR 法检测SMC 中RhoA、ROCK1 mRNA表达

按TRIzol 试剂说明书，提取各组细胞总RNA。根据TaKaRa试剂盒说明书，按10 μL体系反转录为cDNA。以获得的cDNA为模板行qRT⁃PCR扩增；反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 个循环。由系统自动记录荧光曲线并分析计算出CT值，以GAPDH 作为内参。RhoA 上游引物5′⁃GTTTATGT⁃GCCCACGGTGTT⁃3′，下游引物5′⁃ACTATCAGGGC⁃TGTCGATGG⁃3′；ROCK1 上游引物5′⁃TGTGAAG⁃CCTGACAACATGC⁃3′，下游引物5′⁃CTGACCAC⁃CAGTCACACTCT⁃3′；GAPDH上游引物5′⁃GGCCTT⁃CCGTGTTCCTACC⁃3′，下游引物5′⁃CGCCTGCTTCA⁃CCACCTTC⁃3′。

1.2.6 验证E2 抑制RhoA/ROCK 通路的核受体（ERα或ERβ）

分别构建ERα、ERβ 的siRNA，待传代细胞长至30%～50%，用脂质体Lipo2000TM将ERα siRNA、ERβ siRNA 分别转染至SMC 中，以沉默ERα 或ERβ表达，qRT⁃PCR 鉴定转染效率，并分为以下组：①对照siRNA 组；②ERα siRNA 组；③ERβ siRNA 组，转染48 h 后予50 nmol/L E2 刺激，qRT⁃PCR、Western blot检测RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表达。以上实验各重复3次。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件，非参数检验之K⁃S检验进行数据正态性分析，各组数据均呈正态分布，数据以均数±标准差（）表示；各组间比较采用单因素方差分析和SNK 法两两比较，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠SMC鉴定及ROCK1、ERα表达

免疫荧光双标结果示结肠SMC上表达ROCK1、ERα（图1）。

2.2 不同浓度和不同时间E2刺激对大鼠结肠SMC中RhoA、ROCK1蛋白和mRNA表达的影响

10、50、100 nmol/L E2 组RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA表达均低于0 nmol/L对照组，呈浓度依赖性，因50 nmol/L 组与100 nmol/L 组差异无统计学意义，故50 nmol/L为E2最适浓度（图2）。

50 nmol/L E2 刺激结肠SMC 6、12、24、48 h 组RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表达均低于0 h 对照组呈时间依赖性，因24 h组与48 h组差异无统计学意义，故24 h为最适时间（图3）。

2.3 不同浓度ROCK 抑制剂Y27632 对其下游蛋白表达的影响

5、10、25、50 μmol/L Y27632 组下游信号蛋白p⁃MYPT1、p⁃CPI17、p⁃MLC 表达明显低于0 μmol/L，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），1 μmol/L组蛋白表达亦低于0 μmol/L，但差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

2.4 鉴定E2抑制RhoA/ROCK通路的受体类型

E2 组RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表达显著低于C组，β受体激动剂DPN组、ICI 182780组、BSA⁃E2组RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 与对照组无明显差异。α 受体激动剂PPT 组RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA表达亦明显低于C组（P均＜0.05，图5）。

2.5 验证E2抑制RhoA/ROCK通路的核受体

转染效率验证：ERα siRNA、ERβ siRNA转染结肠SMC 后，其mRNA 表达均显著低于转染对照组（图6A）。

siRNA 转染SMC 48 h 后予E2 刺激，ERα siRNA组RhoA、ROCK1 蛋白及mRNA 表达高于对照组（图6B），ERβ siRNA组与对照组差异无统计学意义。

3 讨论

胃肠道动力障碍性疾病是临床常见病、多发病，大量临床研究显示女性发病率高于男性，提示女性激素在胃肠动力的抑制性调节中有重要作用［17-19］。多项研究证实雌激素可松弛膀胱、子宫、尿道等部位平滑肌［20-21］，但对结肠平滑肌收缩的直接作用鲜有研究。

RhoA 是小G 蛋白Rho 亚家族成员之一，分布于大多数具有收缩功能的细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞［22］等，ROCK 是其下游最主要的效应分子。ROCK 包括ROCK1 和ROCK 2 两种亚型，其中，ROCK1 广泛分布于各种组织中，而ROCK2 主要分布于骨骼肌和脑组织中［23］。本研究对体外培养的SMC 进行α⁃SMA 与ROCK1 荧光标记，均呈阳性表达，提示大鼠结肠SMC 上有RCOK1 表达。RhoA/ROCK 通路可抑制MLCP 活性，增加SMC 对钙离子敏感性（钙敏化机制），使MLC 磷酸化水平增加，收缩加强［11，24］。研究发现RhoA/ROCK 可通过钙敏化机制调控膀胱、尿道、冠脉等平滑肌收缩活动［14-15］。Chrissobolis 等［25］发现雌激素可抑制大脑基底动脉平滑肌RhoA/Rho⁃kinase 活性。Rigassi 等［13］发现甲氧雌二醇可抑制人血管平滑肌RhoA 活化，并可减少MLC及MLCP调节亚基的表达。而结肠平滑肌中RhoA/ROCK 的表达与雌激素的关系尚不明确。本研究在细胞水平上发现E2可抑制大鼠结肠SMC 中RhoA/ROCK通路的表达。

雌激素可通过与膜受体（mER）或核受体（ERα、ERβ）结合发挥作用［26-27］，本研究发现E2 处理后RhoA/ROCK 表达下降，而非细胞膜通透的BSA⁃E2处理后不影响RhoA/ROCK表达，提示雌激素可通过核受体（ERα、ERβ）途径发挥作用。α受体激动剂PPT 处理后亦可抑制RhoA/ROCK 表达，ERα干扰后，E2诱导的RhoA/ROCK表达上升，验证了雌激素可通过α受体抑制RhoA/ROCK通路表达。

人体内雌激素可随着年龄、妊娠、月经期等不断变化，不同阶段雌激素作用是否不同还仍待进一步研究。雌激素是否通过ERα直接介导了RhoA/ROCK通路表达亦有待研究。