miR⁃1247对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

胡 华，周 忠

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院骨科，湖北 武汉 430014

骨肉瘤是常见的骨恶性肿瘤，具有易转移、恶性程度高、预后差等特点，在青少年和老年人中发病率较高［1］。患者5 年生存率为60%～70%，但是对转移性骨肉瘤患者，5 年生存率低于20%［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA，长度约19～25个核苷酸，在转录后水平抑制靶mRNA，进而影响肿瘤细胞生物学过程［3］。miR⁃1247是一种与人关节软骨细胞分化及表型高度相关的miRNA 家族成员［4］。研究发现，miR⁃1247 与胰腺癌预后相关且可通过靶向神经素（neuropilins，NRP）抑制细胞增殖［5］。miR⁃1247 在去势抵抗性前列腺癌中表达上调［6］。然而，目前尚未见miR⁃1247对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。本研究旨在探讨miR⁃1247在骨肉瘤细胞系中的表达及对增殖和凋亡的影响，并阐明其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

骨肉瘤细胞系Saos⁃2、U2OS、143B 及人正常成骨细胞系hFOB1.19购自中国医学科学院细胞库，实验所需的SOX9 和FAM129B 一抗（Invitrogen 公司，美国），二抗（Santa Cruz公司，美国），LipofectamineTM2000 reagent（Invitrogen 公司，美国）。miR⁃1247 mimics和阴性随机对照序列scramble的设计及合成均由上海吉玛生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组

Saos⁃2、U2OS、143B 及人正常成骨细胞系hFOB1.19 均种植于RPMI 1640 培养基，待48 h 后经消化传代，Saos⁃2 细胞系分成两组，即miR⁃1247 过表达组（miR⁃1247组）和阴性随机对照组（EV组），利用LipofectamineTM2000分别转染miR⁃1247 mimics和阴性随机对照序列scramble。miR⁃1247 mimics 序列：上游5′⁃GTTGTTTTTTATTTTGGGAATGTTGA⁃3′，下游5′⁃AAAAATACACACTTAACACATCCAAA⁃CACC⁃3′；miR⁃1247 scramble序列：上游5′⁃UUCUCC⁃GAACGUGUCACGUTT⁃3′，下游5′⁃ACGUGACAC⁃GUUCGGAGAATT⁃3′，转染浓度为300 nmol/孔。

1.2.2 RNA提取及实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）

提取RNA 后，采用NanoDrop1000 分光光度计对RNA 浓度进行测定，在7900 HT 荧光定量PCR系统（Applied Biosystems 公司，美国）测定。通过阈值分析比较，采用循环数（Ct）法对数据行分析处理。内参采用U6，采用2-ΔΔCt法量化miR⁃1247 的表达水平。

1.2.3 细胞增殖水平测定

采用MTT法测定细胞增殖能力，将miR⁃1247组和EV组经消化后的细胞悬液，以2×103个/孔种植于96孔板上，每孔按200 μL的体积上样，经0、1、3、5、7 d 培养后，每孔加入20 μL MTT，经培养1 h 后，酶标仪测定450 nm 波长下各孔的吸光值D（450 nm），并绘制细胞增殖曲线，纵坐标为吸光值，横坐标为时间。

1.2.4 细胞凋亡水平测定

采用流式细胞术测定，将miR⁃1247 组和EV 组细胞消化成细胞悬液后，采用Binding Buffer 重悬，漂洗2 次后，加入Annexin V，避光染色10 min后，加入PI染料，上流式细胞仪检测，凋亡细胞为Annexin V阳性，PI 阴性细胞，计算凋亡细胞比例，实验重复3 次，取平均值。

1.2.5 蛋白印迹分析（Western blot）

对miR⁃1247 组和EV 组细胞裂解变性，按每孔30 μg的标准上样，浓缩胶条件为50 min 80 V，分离胶条件为100 min 100 V，常规转膜，加入SOX9 和FAM129B一抗，抗体浓度为1∶200，于4℃孵育过夜，二抗（1∶500）在37 ℃条件下孵育，并经4 h孵育后，漂洗3 次，ECL 液显影，目标蛋白灰度值采用Quantity One 1⁃D 软件分析。计算公式：目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH 灰度值，实验重复3 次后，取均值计算。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0统计软件行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间的比较采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃1247低表达于人骨肉瘤细胞

qRT⁃PCR 示，miR⁃1247 在人正常成骨细胞系hFOB1.19的相对表达量为1.00±0.02，在人骨肉瘤细胞系U2OS、Saos⁃2、143B 细胞系中相对表达量分别为0.31±0.02、0.39±0.03、0.45±0.04，miR⁃1247在骨肉瘤细胞系中的相对表达量低于人正常成骨细胞系hFOB1.19（P＜0.05，图1）。

2.2 miR⁃1247过表达抑制骨肉瘤细胞系U2OS增殖

转染24 h后，miR⁃1247组miR⁃1247相对表达量为19.72±0.87，EV 组为1.00±0.03，miR⁃1247 组miR⁃1247 相对表达量显著高于EV 组（P＜0.001），提示转染成功，可行后续实验（图2A）；MTT示：转染后0、1、3、5、7 d，EV 组和miR1247 组D（450 nm）值分别为：0.25±0.02vs.0.24 ± 0.02（P＞0.05），0.35 ± 0.03vs.0.37 ± 0.03（P＞0.05），1.37 ± 0.07vs.1.07± 0.06（P＞0.05），2.47 ± 0.15vs.1.67 ± 0.08（P＜0.01），4.03±0.25vs.2.38±0.19（P＜0.001，图2B）。

2.3 miR⁃1247过表达抑制骨肉瘤细胞U2OS凋亡

流式细胞术显示，miR⁃1247 组细胞凋亡率为（17.90±1.26）%，EV 组为（8.50 ± 1.98）%，miR⁃1247组细胞凋亡率高于EV组（P＜0.01，图3）。

2.4 miR⁃1247 过表达对SOX9 和FAM129B 表达的影响

Western blot 显 示，miR ⁃ 1247 组SOX9 和FAM129B 蛋白相对表达量分别为0.47±0.04、0.37±0.04，EV 组分别为1.00±0.02、1.00±0.03，miR⁃1247组SOX9 和FAM129B 蛋白表达量低于EV 组（P＜0.01，图4）。

3 讨论

骨肉瘤发病率约10万分之0.3，发病高峰在青春期，平均为16岁，65%的骨肉瘤好发于四肢［1］。化疗耐药及肺转移是导致患者生存率低的主要原因［2］。

miR⁃1247 与多种肿瘤发生发展有关［5-6］。在胰腺癌中，miR⁃1247下调表达，且与预后差相关，在胰腺癌细胞系中上调表达miR⁃1247可抑制增殖、克隆形成，并诱导G0/G1细胞周期阻滞，起抑癌基因的作用［5］。在去势抵抗的前列腺癌中，miR⁃1247⁃5p上调表达［6］。研究发现，miR⁃1247 在骨肉瘤干细胞中表达下调，且沉默靶基因MAP3K9后，干细胞增殖和克隆形成能力明显减弱［7］。在本研究中，miR⁃1247 低表达于骨肉瘤细胞系U2OS、Saos⁃2、143B，其过表达明显抑制U2OS 细胞增殖并促进凋亡，提示miR⁃1247 是作为抑癌基因参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡过程。

SOX9 基因是一个与骨骼畸形综合征、躯干发育异常高度相关的转录因子，在软骨分化过程中起关键作用［8］。在胰腺癌细胞中，SOX9蛋白异常高表达，通过影响细胞周期调节因子p21及CDK4参与调控细胞生长和转移［9］。本研究发现miR⁃1247 过表达显著抑制SOX9 蛋白水平，说明SOX9 可能作为miR⁃1247的下游靶基因，参与骨肉瘤的发生发展过程。研究发现，SOX9 是肿瘤相关信号通路的正调节因子，SOX9 过表达激活乳腺癌Wnt/β⁃Catenin 信号通路，同时诱导该信号通路组件低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）和T 细胞因子4 基因的表达［10］。Wnt/β⁃Catenin信号通路是一个高度复杂的信号转导通路，具有调节基因表达、侵袭、迁移、增殖等功能，它的激活对骨肉瘤的发生发展起促进作用［11］。前人研究发现，miR⁃1247 发挥对SOX9 的靶向调控作用是通过结合在SOX9编码区中高度保守结构域实现的，且它们之间还存在负反馈回路［4］。提示，miR⁃1247 可能通过结合SOX9 编码区特异性序列，降低SOX9 蛋白转录水平，同时负反馈回路加深这一影响，使得Wnt/β⁃Catenin 信号通路受抑制，从而阻碍骨肉瘤细胞增殖和侵袭。

FAM129B 是近期发现的Wnt/β⁃Catenin 的正调节因子，通过与KEAP1 形成复合体抑制TNFα凋亡途径、促进NF⁃κB信号通路，阻碍肿瘤细胞凋亡、促进细胞侵袭［12］。之前研究发现，miR⁃1247在肿瘤中低表达，可能损害相关靶基因的表达，如细胞凋亡基因FAM129B［13］。本研究证实了FAM129B 蛋白受miR⁃1247 过表达影响而表达下调，影响FAM129B与KEAP1之间的相互作用，进而抑制Wnt/β⁃Catenin和NF⁃κB信号通路，TNF⁃α凋亡途径被激活，这可能是影响骨肉瘤细胞凋亡的机制。

综上，miR⁃1247 可通过抑制其靶基因SOX9 及FAM129B 的转录后水平表达，抑制细胞增殖、促使凋亡，miR⁃1247的功能及作用机制的研究有望为骨肉瘤的诊治提供一种新的分子靶点。