芽孢杆菌抗菌肽调控基因的PCR 检测及其抑菌活性

朱洪磊，马 超，郭洁心，王 勇，张宝俊

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，可通过核糖体途径合成SubtilosinA、TasA 等细菌素类物质[1]，也可通过非核糖体途径合成伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（Surfactin）、芬荠素（Fengycin）、溶杆菌素（Bacilysin）等抗菌脂肽。与抗生素相比，抗菌脂肽分子量介于300～3 000 u，具有抑菌效果好、副作用小、病原菌产生抗性的概率低等特点，在植物病害微生物防治方面具有重要的应用前景。

不同脂肽类抗菌物质由不同的基因所调控。现有研究表明，由脂肽类物质合成酶基因簇调控产生的Surfactin、Iturin 和Fengycin 等脂肽类抗菌物质，对包括许多植物病原细菌、真菌和卵菌等具有较好的拮抗活性[2-5]，其中，IturinA、Fengycin、Bacillomycin合成酶基因抑菌活性较高[6-8]。抗菌脂肽类物质的分离纯化是对其结构、功能等研究的前提，但抗菌脂肽类物质由于含量少、分子量低、分离纯化步骤较为复杂且难以保证提取物的纯度[9-11]，使其深入研究存在一定困难。随着分子生物学信息技术的快速发展，多种芽孢杆菌的基因组已被测定与分析，为深入研究芽孢杆菌抗菌肽调控基因提供了可能。

本研究针对不同抗菌物质的调控基因设计引物，通过PCR 检测及抑菌活性测定，分析其分泌抗菌物质的主要类型，筛选同时具备多种抗菌脂肽合成酶基因的拮抗菌株，旨在为潜在生防菌株的筛选提供一种更加快速、可靠的检测方法，同时为抗菌脂肽在抗菌机制及应用研究等方面提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 PG-1、LJ-23、jm7、DS-1、PT-6、XJ8、TD-8、NJj、jm2、G-1、X8、ZSH-2、HS-11、LB-2、GFP、G-5、jm6、jm5、BC-1、TC-4 等20 株芽孢杆菌均为山西省植物内生菌服务共享平台分离菌种，保存于山西省绿色生物农药工程技术研究中心。

1.1.2 供试药剂及培养基 SanTaq PCR Mix 预混液、DNA 分子标量均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌30 min 后备用；LB 培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 值7.0，121 ℃灭菌30 min 后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 检测基因的PCR 扩增 采用SDS 法[12]提取细菌基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测后备用。针对Surfactin、BacillomycinD、Fengycin、Iturin、Bacilysin、Mycosubtilin 合成酶调控基因设计15 对特异引物（表1）。

表1 抗菌脂肽相关基因的引物序列

PCR 扩增反应体系（25 μL）为：SanTaq PCR Mix 12.5 μL，上游引物（10 mmol/L）1 μL，下游引物（10 mmol/L）1 μL，超纯水9.5 μL，DNA 模板1 μL。扩增程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min，扩增30 个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 聚类树的构建 以PCR 扩增的DNA 谱带为单位，有带赋值为1，无带赋值为0，采用NTSYS软件进行各菌株间UPGMA 聚类分析，构建聚类树。

1.2.3 抑菌活性测定 采用生长速率法[13-14]，以立枯丝核菌为指示菌，对供试菌株的抑菌活性进行测定。将20 个菌株分别接种于LB 培养液，30 ℃、180 r/min 振荡培养72 h 后8 500 r/min 离心15 min；收集上清液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后按1∶9（V∶V）与PDA 培养基混合，制备平板；接种直径为5 mm 病原菌于平板中央，25 ℃恒温培养5 d，测定病原菌直径，计算其抑菌率。以无菌发酵液为对照，3 次重复。

2 结果与分析

2.1 脂肽合成酶基因检测结果

2.1.1 Iturin 合成酶基因的PCR 扩增结果 Iturin 合成酶编码基因由ituA、ituB、ituC 和ituD 组成，ituA、ituB、ituC、ituD 这4 对引物对20 个菌株的扩增结果如图1 所示，其中，jm7、DS-1、PT-6、XJ8、TD-8、NJj、jm2、G-1、X8、ZSH-2、GFP、G-5、jm6、jm5、BC-1等15 个菌株均可扩增到单一条带，且与预扩增片段相符；TC-4 菌株仅在ituB 引物下扩增到目的片段；PG-1、LJ-23、HS-11、LB-2 这4 个菌株在4 对引物检测条件下，均无扩增条带。

2.1.2 Fengycin 合成酶基因的PCR 扩增检测结果

Fengycin 合成酶编码基因由fenA、fenB、fenC、fenD、fenE 组成。由图2 可知，fenB3 引物可实现jm7、DS-1、PT-6、XJ8、TD-8、NJj、jm2、G-1、X8、ZSH-2、LB-2、GFP、G-5、jm6、jm5、BC-1 等16 个菌株的特异扩增；fenB4 引物可实现LJ-2、PT-6、XJ8、TD-8、NJj、jm2、G-1、ZSH-2、GFP、G-5、jm6、jm5、BC-1 等13 个菌株的特异扩增；在fenB6、fenD3 引物检测下，仅PG-1、LJ-23、HS-11、LB-2 等4 个菌株扩增到特异条带。

2.1.3 Bacillomycin D 合成酶基因的PCR 扩增检测结果 Bacillomycin 合成酶编码基因由bmyD、bmyA、bmyB、bmyC 组成。从图3 可以看出，bmyA、bmyB 引 物检测下jm7、DS-1、PT-6、XJ、TD-8、NJj、jm2、G-1、X8、ZSH-2、GFP、G-5、jm6、jm5、BC-1 等15 个菌株均可扩增到单一条带，且与预扩增片段相符；bmyB 引物可实现PG-1、HS-11、TC-4 等3 个菌株的特异性扩增；在bmyC 引物检测下，仅XJ8、ZSH-2、G-5 等3 个菌株扩增到特异性条带。

2.1.4 Surfactin 合成酶基因的PCR 扩增检测结果

Surfactin 合成酶编码基因由srfA-A、srfA-B、srfA-C、srfA-D 构成。由图4 可知，在srfA-C 引物检测下，20 个菌株均可扩增到单一条带，且与预扩增片段相符。

2.1.5 Mycosubtilin 合成酶基因的PCR 扩增检测结果 Mycosubtilin 合成酶编码基因由mycA、mycB、mycC 组成。由图5 可知，在mycA 引物检测下，PG-1、LJ-23、HS-11、LB-2、TC-4 等5 个菌株无扩增条带；在mycC 引物检测下，仅LB-2 菌株无扩增条带。

2.1.6 Bacilysin 合成酶基因的PCR 扩增检测结果

Bacilysin 合成酶编码基因由bacA、bacB、bacC、bacD、bacE 构成。由图6 可知，在bacD 引物检测下，20 个菌株均可扩增到单一条带，且与预扩增片段相符。

2.2 聚类分析及抑菌活性分析

2.2.1 聚类分析 基于各引物PCR 扩增条带的有无，采用UPGMA 法构建聚类树如图7 所示，在0.71分类水平上，20 个菌株被划分为3 类，其中，PG-1、HS-11、LJ-23、LB-2 等4 个菌株聚为第Ⅰ类；TC-4菌株单独聚为第Ⅱ类；jm7、DS-1、PT-6、TD-8、NJj、jm2、G-1、X8、GFP、jm6、jm5、BC-1、XJ8、ZSH-2、G-5 等15 个菌株聚为第Ⅲ类。

2.2.2 菌株抑菌活性分析 以LJ-23、TC-4、ZSH-2菌株为代表进行抑菌活性测定，结果表明（表2），3 株拮抗菌的抑菌活性存在差异，第Ⅰ类LJ-23 菌株对立枯丝核菌的抑菌率为18.03%，第Ⅱ类TC-4菌株对立枯丝核菌的抑菌率为53.42%，第Ⅲ类ZSH-2 菌株对立枯丝核菌的抑菌率为84.27%，且3 个不同菌株的抑菌率间达显著水平。

表2 3 个菌株对立枯丝核菌的抑菌活性分析

3 结论与讨论

脂肽类抗菌物质作为芽孢杆菌代谢产生的一类重要抗菌物质，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。姬婧媛等[15]研究表明，经Fengycin 处理的小麦全蚀病菌出现细胞畸形、细胞壁溃解、细胞质外渗，生长受到抑制。XU 等[16]通过杆菌霉素D 缺失突变体的构建，得出杆菌霉素在拮抗尖孢镰刀菌中起关键作用。曲晓旭等[17]建立了芽孢杆菌产抗菌脂肽调控基因快速检测的方法，用于拮抗微生物是否具有抗菌脂肽分泌能力的判定。本研究通过芽孢杆菌产抗菌脂肽调控基因的特异引物设计及PCR检测，结果发现，ZSH-2 菌株可检测到Iturin、Surfactin、Fengycin 及Bacilysin 这4 类合成酶调控基因；TC-4 菌株可检测到Iturin、Surfactin、Baciysin 及Bacillomycin D 这3 类合成酶调控基因；LJ-23 菌株可检测到Surfactin、Fengycin 及Baciysin 等3 类合成酶调控基因；同时，测定ZSH-2、TC-4、LJ-23 菌株对立枯丝核菌的抑菌率分别为84.27%、53.42%、18.03%，表明抗菌物质种类不同，其抑菌活性存在较大差异；研究还发现，含有ituB、fenB、bmyB 基因可以增强菌株的抑菌活性，这与OLFA 等[18]在筛选生防菌株时得出的结论一致。

本研究还表明，LJ-23 菌株中检测到Fengycin合成酶调控基因，但其抑菌活性较低，是否与其基因的表达量或与该菌株的抑菌谱较窄有关，还有待进一步研究。下一步研究将对菌株抗菌物质进行分离及活性测定，以验证PCR 检测的准确性，快速检测筛选高效拮抗菌株，为微生物菌剂的研发奠定基础。