基因编辑CRISPR/Cas9技术在农业领域的应用

宋丽莉，黄艳娜，蒋 玮，郑洪建，赵子轶，唐雪明*

(1上海市农业科学院生物技术研究所，农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心(上海)，上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106；2上海市农业科学院作物育种栽培研究所，CIMMYT-中国特用玉米研究中心，上海201403；3上海容晖生物科技有限公司，上海200231)

随着世界人口的增长和气候的变化，如何提高作物的产量和质量是科研工作者面临的重要问题。作物改良育种主要依赖于遗传变异(自然诱变，物理诱变和化学诱变剂诱变)、T-DNA(Transfer DNA)插入突变或转座子标签。近年来，新兴的基因组编辑技术在作物改良方面取得了显著的成果。基因编辑技术是序列特异核酸酶在基因组水平上对靶标基因进行定向、准确修饰的一种基因工程方法。本文主要介绍CRISPRCas9基因编辑系统的结构特征、工作原理、在作物基因功能研究和作物育种方面的应用以及该技术在农业上的应用潜力和发展前景。

1 基因编辑技术概述

目前，基因编辑技术应用中的关键工程核酸酶主要分为3类，分别是类转录激活子效应蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)、锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)以及新近发展的CRISPRCas系统(The clustered regularly interspersed shortpalindromic repeatsCRISPR-associated)。基因编辑技术通过序列特异性核酸酶识别、锚定基因组上的靶标位点序列，切割目标DNA产生双链断裂，通过同源重组或非同源末端连接进行DNA修复，使基因组特定位点出现碱基缺失、插入或替换，进而实现对基因组的定向修饰[1]。ZFNs和TALENs主要通过DNA识别结构域(ZF或TAL效应子)与核酸酶结构域的融合而形成嵌合蛋白，由于组装ZFNs和TALENs的DNA识别结构域的表达单元比较复杂，靶点切割效率较低，而CRISPR技术通过一段向导RNA和配套的核酸酶对特定的基因组序列进行定点编辑，具有操作简单、编辑高效、成本低廉等优点。目前，CRISPR 基因编辑技术广泛应用于模式植物(拟南芥、烟草)[2-3]和一些主要农作物(水稻、小麦、玉米等)[4]，促进了植物基因功能研究和预期农艺性状的选择。

2 CRISPRCas9系统基本结构特征及工作原理

2.1 基本结构特征

2.2 工作原理

CRISPR 系统是细菌的一套免疫系统，用于对抗噬菌体或其他病毒的侵染。该系统分为3个类型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPRCas系统较为复杂，需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而CRISPRCasⅡ型系统只需要一个Cas9蛋白核酸酶来切割DNA双链。CRISPRCasⅡ型系统由Cas9蛋白核酸酶、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)组成。当噬菌体或其他病毒侵染宿主时，外源DNA中特定的前间隔序列和其邻近基序将被宿主的CRISPR系统识别，宿主将形成“记忆”，即将重复片段和这一段新的间隔序列插在前导序列和第一个重复序列之间，将其整合进入CRISPR 系统。当同一噬菌体或其他病毒再次侵染时，在前导序列作用下，CRISPR 序列通过转录、加工形成小crRNA，然后与tracrRNA复合体形成sgRNA(Single guide RNA)。最后，在sgRNA的作用下，tracrRNA引导CRISPRCas9蛋白识别和切割靶基因，Cas9蛋白复合体通过干扰入侵的噬菌体或其他病毒的DNA 序列，使宿主免受同一噬菌体或其他病毒的二次侵害[6]。

3 CRISPRCas9基因编辑技术在基因功能研究中的应用

非同源末端连接是用来修复植物DNA双链断裂的主要途径，该过程通常会产生小于100 bp序列的缺失或插入。编码区序列缺失或插入将产生移码突变，导致基因功能丧失，这种突变在植物后代可以稳定遗传。

3.1 单碱基突变

基因编辑技术解决了单碱基定点突变材料获得难的问题。借鉴哺乳动物单碱基编辑方法，Zong等[7]成功构建了高效植物单碱基编辑系统nCas9-PBE，并在小麦、水稻和玉米三大重要农作物基因组中实现了高效、精确的单碱基定点突变。D’Ambrosio C等[8]利用CRISPRCas9技术分别对番茄类胡萝卜素生物合成关键基因Psy1和CrtR-b2进行编辑，获得单碱基插入或缺失的突变体。Hua等[9]等开发的一系列碱基编辑器实现了对水稻基因组DNA四种碱基的编辑替换，这对水稻基因功能解析和现代分子育种研究具有重大推进作用。

3.2 多重基因突变

多重基因编辑不仅可以用于基因家族功能的研究，还可以快速聚合农作物的多个性状。Xiong等[10]利用CRISPRCas9系统靶向油菜果胶酯酶基因Bra003491，Bra007665和Bra014410，并成功获得两个目标基因突变的株系。Zhu等[11]利用CRISPRCas9系统成功地获得拟南芥CBF1、CBF2和CBF3基因同时突变的植株。

4 CRISPRCas9基因编辑技术在作物改良上的应用

基因编辑技术作为高效的辅助育种手段已被用于改良作物性状(表1)，包括提高作物产量、作物营养品质，抗病性等[12-14]。

4.1 作物产量

作物的产量受籽粒数量、大小和重量等影响[15]。敲除负调控水稻产量的基因，如GS3、DEP1、GS5、GW2、Gn1a和TGW6，是提高作物产量的一种简单、直接的方式[16]。Xu等[17]利用CRISPR技术同时敲除GW2、GW5和TGW6基因获得的水稻三突变体千粒重增加29.8%。GASR7是核宽度和重量的负调节因子，利用CRISPRCas9敲除面包小麦GASR7三个同源基因的突变体千粒重有所增加[18]。然而，增加单株千粒重并不一定能提高作物产量，还需通过大规模田间试验验证。

4.2 作物营养品质

Sun等[19]通过CRISPRCas9技术敲除淀粉分支酶基因SBEI和SBEIIb，获得的大米直链淀粉含量高。玉米Waxy(Wx)基因编码颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)，负责籽粒直链淀粉合成，野生型玉米籽粒支链淀粉和直链淀粉含量分别为75%和 25%，而wx/wx突变株糯玉米支链淀粉含量近100%[20]。Zhang等[21]利用CRISPRCas9技术敲除Waxy基因，获得了有经济价值的糯稻。黄忠明[15]利用CRISPRCas9技术对TMS5基因进行编辑，发现水稻对温度的敏感阈值快速升高。孙慧宇等[22]利用CRISPRCas9技术对Badh2基因进行编辑，改良了粳稻的香味。FAD2基因家族调控油酸(单不饱和脂肪酸)向亚油酸的转化[23]，Abe等[24]利用CRISPRCas9技术获得OsFAD2-1基因敲除纯合水稻，发现突变体油酸含量增加，且未检测出亚油酸。

4.3 抗病

植物病害不仅影响作物产量，还影响许多作物的鲜食生产和食品加工与安全。通过对MLO基因家族成员进行基因编辑，获得的mlo基因缺失突变体对小麦白粉菌(Bgt)引起的白粉病具有较持久的抗性。经CRISPRCas9修饰番茄SIMLO1基因后，提高了番茄对白粉病的抗性[25]。Kis等[26]利用CRISPRCas9技术创建的大麦对小麦矮缩病毒具有高效抗性。真核翻译起始因子eIF4E是维持植物生命周期RNA病毒寄主因子。利用CRISPRCas9技术对eIF4E基因进行编辑，获得的黄瓜突变体具有抗病毒性[27]。柑橘CsLOB1是宿主疾病易感基因，该基因促进病原菌的生长形成脓疱，Jia等[28]利用CRISPRCas9靶定CsLOB1基因，获得了抗溃疡病的柑橘植株。Shao 等[29]利用CRISPRCas9技术对MaGA20ox2基因进行编辑获得具有抗倒伏性状的半矮秆香蕉。

表1 CRISPRcas9基因编辑技术在作物改良中的应用

Table 1 Application of CRISPRcas9 genome editing for crop improvement

表1 CRISPRcas9基因编辑技术在作物改良中的应用

作物基因修饰方式表型水稻TMS5[15]基因敲除温度敏感阈值增加水稻GW2∕GW5∕TGW6[17]基因敲除增加产量水稻SBEI and SBEIIb[19]基因敲除直链淀粉含量高水稻Waxy[21]基因敲除糯性增加水稻Badh2[22]基因敲除改变香味水稻FAD2-1[24]基因敲除油酸含量增加水稻EPSPS[30]基因敲除抗除草剂玉米Waxy[20]基因敲除糯性增加小麦GASR7[18]基因敲除千粒重有所增加大麦WDV[26]基因敲除抗小麦矮缩病毒黄瓜Eif4e[27]基因敲除抗病毒柑橘CsLOB1[28]干扰启动子抗溃疡病番茄SIMLO1[25]基因敲除抗白粉病番茄Psy1∕ CrtR-b2[8]基因敲除类胡萝卜素增加油菜Bra003491∕Bra007665∕ Bra014410[10]基因敲除果胶酯增加香蕉MaGA20ox2[29]基因敲除抗倒伏

4.4 抗除草剂

EPSPS基因编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，参与芳香族氨基酸生物合成，是植物生存所必需的合成酶。草甘膦是一种广泛使用的除草剂，它可以结合EPSPS功能位点阻止其活动。EPSPS基因经CRISPRCas9系统编辑后，亚麻抗草甘膦耐受性显著提高。利用同样的方法对EPSPS基因进行碱基替换，可获得抗草甘膦水稻植株[30]。

ALS是编码乙酰乳酸合成酶的基因，参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸的生物合成[3]。ALS抑制剂泛指除草剂，包括磺酰脲类，咪唑啉酮，三唑并嘧啶和磺酰氨基羰基三唑啉酮，通过慢慢“饿死”这些氨基酸进而导致植物DNA合成受到抑制。ALS保守区域特定的点突变，可提高植物对除草剂的抗性。Svitashev等[31]利用CRISPRCas9技术定点编辑ALS基因获得抗除草剂的玉米、大豆、水稻植株。

5 展望

近期，美国农业部裁定经CRISPR编辑改良的作物(如蘑菇和糯玉米)不含有外源DNA，因此被免除转基因监管。Cas9蛋白-gRNA核糖体组装体已在水稻、小麦和玉米等细胞中成功完成基因编辑，这意味着新的、高效的无DNA基因组编辑方法有望在不久的将来得到发展，并应用于更多的作物[32]。

随着高通量测序技术的发展，核桃、苹果、草莓、葡萄等植物基因组数据的公开将推动基因组编辑技术对作物性状、营养品质等方面的研究。然而，许多优良品种和具有重要商品价值的作物都难以实现高效转化。Zhao等[33]利用纳米磁珠作为CRISPR复合体的载体进行瞬时表达，实现DNA-free基因编辑。Kelliher等[34]将单倍体诱导育种与基因编辑技术结合，在短时间内完成已商业化的玉米品种改良。鉴于基因组编辑技术的不断开发和完善，作物改良育种必将发生革命性的变化，这也将为我国农业快速发展提供技术基础。