猪Delta冠状病毒的流行病学调查及M基因序列分析

马玉飞，李本强，陶 洁，程靖华，刘 雷，刘惠莉*

(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海种猪工程技术研究中心，上海 201106；2 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)、δ-冠状病毒属(Deltacoronavirus)，是一种新发现的单股正链RNA病毒，主要感染小肠，尤其是空肠末端和回肠，可引起严重的肠炎并伴有腹泻、脱水等症状，临床特征与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似，但该病毒可致哺乳期仔猪产生较高死亡率，给养殖业带来严重的经济损失。Ma等[1]将分离到的PDCoV病毒接种新生仔猪，所有接种猪只均发生水样腹泻、呕吐等流行性腹泻样症状。

PDCoV基因组全长大约25 kb，是所有冠状病毒中基因组最小的，其基因组成、排列与其他冠状病毒相似，包括5’和3’非翻译区以及7个开放阅读框，编码4 种主要的结构蛋白：纤突(S)蛋白、囊膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。研究表明，PDCoV 的M基因在不同毒株之间的同源性大于90%，与其他冠状病毒M基因的同源性均小于50%[2]。PDCoV作为猪病毒性腹泻的新病原，逐渐受到了关注，继美国成功分离到2株PDCoV之后[3]，陈建飞等[4]成功分离到了国内首株PDCoV。但因很多腹泻类病毒都主要感染小肠部位，运用传统方法中的临床剖检和显微镜观察很难将PDCoV与其他猪腹泻病毒加以区分。本研究以PDCoV保守的M基因为扩增目的片段，建立RT-PCR检测方法，并对临床PDCoV感染情况进行监测分析，为了解PDCoV在猪腹泻疫病中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品与病毒

2015—2017年从上海及周边猪场采集518份有腹泻症状猪的粪便样品。

猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及大肠杆菌(E.coli)由本实验室保存。

1.2 主要试剂

M-MLV RNA聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、500 bp DNA Maker、pMD-18T载体等PCR试剂均购自TaKaRa公司(日本)；DH5α感受态细胞由本实验室提供。质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中已发表PDCoV 毒株的M基因序列，应用DNASTAR和Oligo 7软件针对M基因保守序列区域设计1对特异性引物，此外，根据参考文献[5-6]，设计并合成猪嵴病毒(PKV)、猪星状病毒(PAstV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TEGV)的检测引物(表1)。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 临床样品的处理与总RNA的提取

将粪便样品用PBS按照1∶5比例稀释，震荡混匀，静置10 min，取250 μL上清液与750 μL Trizol裂解液，震荡混合，冰浴静置10 min；加入200 μL三氯甲烷，震荡混匀，冰浴静置5 min，4 ℃ 12 000 rmin离心15 min；吸取上清，加入等体积的异丙醇，-20 ℃沉淀15 min；4℃ 12 000 rmin离心15 min；弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤；4℃ 12 000 rmin离心15 min，弃上清并吹干；用20 μL无RNase DEPC水溶解RNA，置于-80℃保存备用。

1.5 反转录

取10 μL RNA，2 μL primer mix，1 μL M-MLV，1 μL RNase inhibitor，4 μL 5×RT M-MLV Buffer，2 μL dNTP，混匀。反应程序：42 ℃ 1 h；75 ℃ 15 min；4 ℃ 1 h。制备的cDNA模板-20℃保存备用。

1.6 RT-PCR反应体系的建立及优化

取2 μL cDNA，2.5 μL 10×PCR Buffer，1.5 μL dNTP，0.5 μL Taq酶，上、下引物各0.4 μL，超纯水补至25 μL。反应程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；X ℃，30 s；72 ℃，30 s,30个循环；72 ℃，10 min；4 ℃保存。设置7个退火温度(X)，分别是：49 ℃、51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃。所得PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 阳性质粒的制备

将PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，16 ℃作用30 min，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂板。挑取平板上单个菌落进行摇菌，菌液PCR进行鉴定，将疑似阳性菌液送公司测序，待序列正确后，将相对应的菌液进行质粒提取，-20℃保存备用。

1.8 RT-PCR方法的特异性检测

以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大肠杆菌(E.coli)反转录制备的cDNA为模板，以无菌水为阴性对照，利用优化后的扩增体系进行RT-PCR扩增，检测该方法的特异性。

1.9 RT-PCR方法的敏感性测定

利用 pMD-18T载体构建重组质粒，测定其浓度并计算拷贝数。进一步将构建的重组质粒按照10-1、10-2、10-3……10-10，进行10倍倍比稀释，以不同稀释度的重组质粒为模板，进行RT-PCR扩增，测定该方法的敏感性。

1.10 临床样品的检测

利用建立的RT-PCR方法对2015—2017年从上海周边猪场采集的518份猪腹泻粪便样品进行PDCoV病原检测。同时，利用其他相关猪腹泻病毒引物(PKV、PAstV、PEDV、TEGV)对PDCoV阳性样本进行检测，以了解PDCoV病原与其他猪腹泻病毒的混合感染情况。

1.11 M基因的遗传进化分析

运用DNAstar软件将测序获得的10份阳性毒株的核酸序列与GenBank中公布的PDCoVM基因序列进行比对分析，并绘制遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测方法的建立

以腹泻粪便样品提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，获得与目的片段大小一致的条带，约为281 bp(图1)，且无非特异性扩增，测序表明所扩增的产物为PDCoV基因片段。

2.2 RT-PCR最佳退火温度的确定

RT-PCR结果显示，Tm在49—61℃时能够特异性的扩增出目的条带，当Tm为53 ℃时所得到的条带相对较亮，故53 ℃为最佳退火温度(图2)。

2.3 RT-PCR灵敏度的确定

将制备的阳性质粒(3.92 x1010copiesμL)10倍倍比稀释后，分别进行RT-PCR试验，如图3所示，RT-PCR检测PDCoV灵敏度的最低拷贝数为3.92 x103copiesμL。

2.4 RT-PCR特异性分析

如图4所示，相同条件下，以SIV、CSFV、PoRV、PEDV、TGEV、大肠杆菌(E.coli)和H2O为模板，未能扩增出条带，而以PDCoV为模版能扩增出特异性目的条带，说明建立的方法特异性强，与其他病原无交叉反应。

2.5 临床样品检测

利用本研究建立的RT-PCR方法对518份猪腹泻样品进行PDCoV检测，结果显示25份样品为阳性，测序证实均为PDCoV，该方法阳性检出率为4.8%。在所检出的阳性样本中，PKV和PAstV与PDCoV的混合感染率分别为40%和48%；PDCoV与PEDV混合感染率为8.0%，未检测到PDCoV与TEGV混合感染的样本。

2.6 PDCoV M基因的遗传进化分析

利用Mega6.0软件对10株上海地区流行毒株PDCoV的M基因进行基因序列的遗传进化分析和同源性比对发现，上海地区流行毒株的M基因间的同源性为95%—99.6%(图5)。进一步序列分析发现，它们与国内PDCoVM基因参考序列的同源性为96.8%—100%，其中FM-1与四川株(S27-2012)和湖北株(CHN-JS-2014)的核酸同源性为100%。

通过分析PDCoVM基因进化树得知，临床检测到的10株上海地区流行毒株(FM-1、FM-2、JD-1、JD-2、JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5、JS-6)的M基因序列与从GenBank中所选取得到PDCoVM基因(表2)参考序列属于同一分支。这些序列与国内报道的猪Delta冠状病毒的亲缘关系较近，而与国外的猪Delta冠状病毒亲缘关系较远(图6)。

表2 M基因进化树参考毒株

3 结论与讨论

PDCoV于2012年首次在香港的猪群中检测到，相继在美国、韩国流行[7]。2015年，董楠等[8]对湖北、江苏、广东、河南、安徽等地规模化猪场的215 份粪便样品进行检测，共检测到14份PDCoV阳性样品，阳性率为6.5%；彭艳伶等[9]对四川省凉山地区猪腹泻样本中的PEDV、PDCoV和GARV进行检测，PDCoV检出率高达33.33%；刘玲玲等[10]利用PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法对河南各地市的252份样品进行检测，PDCoV阳性率12.30%。本研究利用RT-PCR方法对2015—2017年上海周边猪场的518份猪腹泻样品进行PDCoV病原检测，结果检测出25份阳性样品，阳性率为4.8%，表明PDCoV在腹泻猪群中存在一定比例。PDCoV、PEDV 和TGEV 均属于冠状病毒，易发生混合感染，且它们感染所引起的临床症状非常相似。 Jung 等[11]对美国俄亥俄州59 份猪腹泻病料检测显示，PDCoV阳性率为29%，PEDV和PDCoV 的混合感染率为42.86%。本研究中，PEDV 和PDCoV 的混合感染率为8.0%，未检测到PDCoV与TEGV混合感染的样本；值得注意的是PKV和PAstV与PDCoV的混合感染率分别为40%和48%，表明PKV和PAstV对于PDCoV的致病力可能起协同或是加重作用。

相比于其他猪冠状病毒，PDCoV的检测和诊断方法仍处在发展中阶段[12]。目前，对于PDCoV病原的检测方法主要包括病原学检测和抗体检测。RT-PCR技术凭借其便捷、灵敏度高、特异性强等特性已成为基因研究和分析的最常用方法之一。病原学检测正是以PCR技术为基础建立的检测方法，Zhang等[13]利用猪Delta冠状病毒的M基因建立了此病毒的多重RT-PCR和TaqMan qRT-PCR检测方法。逢凤娇等[14]建立了PDCoV的RT-PCR检测方法，PDCoV最低检测限为6.33×104copiesμL。郑兰兰等[15]利用荧光定量PCR技术建立了猪δ冠状病毒的检测方法。在抗体检测方面，Thachil等[16]以S1蛋白和N蛋白作为包被抗原，建立了PDCoV抗体的间接ELISA检测方法，并运用此方法对355份血清样本进行了检测。

本研究建立的RT-PCR方法，具有较好的灵敏性和较强的特异性，最低检测限量可达3.92×103copiesμL，其灵敏度高于逢凤娇等[14]建立的方法。对扩增的M基因同源性分析表明，10株上海地区流行毒株的M基因间的同源性达95.0%—99.6%，与GenBank登录的其他PDCoVM基因序列同源性为96.1%—100%，说明本研究检测到的PDCoV流行株之间遗传差异较小，但仍需持续监测。