屎肠球菌B13产乳酸菌素的发酵条件优化

魏婕，丁爽，张明，罗敏，周珊，罗璠

（西南民族大学生命科学与技术学院，现代生物技术国家民委重点实验室，青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都610041）

乳酸菌细菌素是由乳酸菌在核糖体合成并分泌的一种具有抑菌活性的蛋白或多肽类物质[1-2]，其作为添加剂使用时具有许多优良性质，如选择性杀菌、对动物无毒性、无抗原性、热稳定性、无副作用、不会对环境造成污染等，因此具有广阔的应用前景[3-4]，成为近年来的研究热点。乳酸菌细菌素可以通过黏在细胞膜上形成通透孔道来达到杀死细胞的目的，还可以通过破坏细胞膜完整性使目标细胞死亡[5-6]。目前许多研究表明添加细菌素有效的提高了各类产品的安全性和品质[7-9]，市场的需求量逐渐提高。

但是，在自然状态下，周围环境以及理化因素对乳酸菌素生物合成过程影响很大[10]。而在实验室培养或工业生产中，乳酸菌素生物合成的能力和产量，除了受菌株自身生长情况的影响外[11]，还受发酵条件如培养基、发酵温度、发酵时间等诸多因素的影响[12]，有研究表明，细菌素的产量和发酵条件有关，但是细菌的最佳发酵条件和细菌的最适生长条件往往是不同的[13]，这种情况造成乳酸菌素的产量很低，严重制约了乳酸菌素的工业化生产及应用。

本试验以实验室自行筛选的高产乳酸菌素屎肠球菌B13为研究对象，其所产的乳酸菌素对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、沙门氏菌以及志贺氏菌等）都具有良好的抑菌性能，有作为天然防腐剂替代抗生素的潜力，因此在单因素试验的基础上用响应面法优化发酵条件，获得该菌产乳酸菌素的最优发酵参数，以提高该菌株细菌素的产量，为进一步的开发利用提供了理论依据和试验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

试验菌株：来源于肠道中的高产乳酸菌素屎肠球菌B13，西南民族大学现代生物技术国家民委重点实验室分离鉴定保藏。

指示菌：金黄色葡萄球菌，西南民族大学现代生物技术国家民委重点实验室分离鉴定保藏。

MRS 液体培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐温 80 1.0 mL，硫酸镁 0.2 g，硫酸锰 0.05 g，去离子水 1 000 mL，121 ℃灭菌 20 min，冷却备用。

MRS 固体培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐温 80 1.0 mL，硫酸镁 0.2 g，硫酸锰0.05 g，琼脂15 g，去离子水1 000 mL，121℃灭菌20 min，倒平板备用。

LB 液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠 10 g，去离子水 1 000 mL，121 ℃灭菌 20 min，冷却备用；LB 固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，去离子水 1 000 mL，琼脂 15 g，121 ℃灭菌 20 min，倒平板备用。

1.2 菌株的活化

将冷冻保藏的屎肠球菌B13划线于MRS 固体培养基中，37 ℃培养24 h；挑取单菌落接种于10 mL 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，作为种子液。

1.3 发酵上清液的制备

将种子液依照2 %的接种量接种于灭菌的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h，得到试验所需的发酵液。离心（6 000 r/min，15 min），弃菌体沉淀，将上清液迅速转移至新的灭菌EP 管中，用HCl 溶液和NaOH 溶液将上清液 pH 调至 6.0，用 0.22 μm 无菌滤膜过滤，4 ℃冷藏保存。

1.4 抑菌活性的测定

运用牛津杯法[14]，取100 μL 金黄色葡萄球菌稀释液（OD600=0.5），用灭菌棉签均匀涂布于事先制备好的LB 固体培养平板上，每个平板上等距放置3 个牛津杯，每个牛津杯加入200 μL 屎肠球菌B13上清液。将上述平板先放在4 ℃冰箱3 h～4 h，使上清液充分渗透到培养基中，再于37 ℃恒温培养箱中，正置培养6 h～8 h。以游标卡尺测定的抑菌圈直径来显示抑菌能力大小，每个处理3 个重复，求其平均值。

乳酸菌素抑菌效价标准曲线的测定：以Nisin（尼生素）标准效价的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，绘制标准曲线，根据标曲推演出回归方程：y=3.55x-10.19（R2=0.996 0），式中：y 为抑菌效价的对数值；x 为抑菌圈直径，mm，由此方程确定屎肠球菌B13所产乳酸菌素的相对效价。

1.5 单因素试验

1.5.1 培养基初始pH 值

按照2%的接种量将培养24 h 的屎肠球菌B13种子液，分别接种到初始 pH 值为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的灭菌的 MRS 液体培养基中，每个处理设置3 个平行，37 ℃恒温培养24 h。检测上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.2 种龄

分别将种龄为 10、12、14、16、18、20、22、24 h 的屎肠球菌B13种子液，按照2%的接种量接种于pH=6.0的MRS 液体培养基中，每个处理设置3 个平行，37 ℃恒温培养24 h。检测上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.3 接种量

将培养24 h 的屎肠球菌B13种子液按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接种量，分别接种于pH=6.0 的MRS 液体培养基中，每个处理设置3 个平行，37 ℃恒温培养24 h。检测上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.4 发酵温度

将培养24 h 的屎肠球菌B13种子液按照2%的接种量，接种到pH=6.0 的MRS 液体培养基中，分别在31、34、37 ℃的条件下发酵 24 h，每个处理设置 3 个平行。检测上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.5 发酵时间

将培养24 h 的屎肠球菌B13种子液按照2%的接种量，接种到pH=6.0 的MRS 液体培养基中，恒温37 ℃，分别发酵 12、14、16、18、20、22、24、36 h，每个处理设置3 个平行。检测上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.6 响应面法优化屎肠球菌B13发酵条件

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理，确定中心组合试验因素与水平，并以相对抑菌效价为响应值进行响应面分析试验，优化屎肠球菌B13产乳酸菌素的发酵条件，试验因素水平及编码见表1。

表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors，levels and codes of response surface tests

1.7 统计分析

首先运用Microsoft Excel 对上述试验所得数据进行初步处理，再利用SPSS 18.0 软件辅助进行分析，最后应用Design Expert 7.1 软件对响应曲面优化数据进行拟合分析，推导拟合方程。数据差异显著性检验采用单因素方差分析（One-way ANOVA）分析，Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 培养基初始pH 值对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响

培养基的初始pH 值对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响结果见图1。

图1 起始pH 值对屎肠球菌B13 合成乳酸菌素的影响Fig.1 Effect of initial pH on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如图1 所示当培养基初始pH 值在5.0～6.0 的范围内，屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效价呈现峰值（P＜0.05），当 pH 值超过 6.0 以后，乳酸菌素的抑菌活性明显降低。因此选取培养基初始pH=5.5 为响应面优化试验的中心试验点。

2.1.2 接种量对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响

接种量对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响结果见图2。

图2 接种量对屎肠球菌B13 合成乳酸菌素的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如图2 所示，接种量达为5%时，相对抑菌效价最高。虽然方差分析表明接种量对屎肠球菌B13合成乳酸菌素无显著影响（P＞0.05），但图中却明确显示出抑菌效价随着接种量的增大呈现先增后减的态势。因此，选取接种量4.5%为响应面的中心试验点。

2.1.3 发酵温度对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响

发酵温度对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响结果见图3。

图3 培养温度对屎肠球菌B13 合成乳酸菌素的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如图3 所示，在31 ℃时，乳酸菌素的抑菌效果最好（P＜0.05），随着培养温度的升高，抑菌效价不断降低。因此，选取培养温度34 ℃作为响应面的中心试验点。

2.1.4 其它因素对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响

试验结果表明种龄和发酵时间对屎肠球菌B13合成乳酸菌素影响不显著（P＞0.05），因此不选用种龄和发酵时间作为考察因素。一般来说，细菌素的合成与菌体自身的生长繁殖存在一定关系。但有研究显示[15]，当菌体细胞生长到中后期时，有害代谢产物不断积累导致细胞自溶，胞内的蛋白酶释放到培养基中，使细菌素被降解，抑菌效价也随之减弱；同时细菌产生的酸性物质在培养液中大量富集，这使得菌体细胞对细菌素产生吸附作用，也会降低培养液的抑菌效价。

2.2 响应面试验分析

2.2.1 回归模型的建立及方差分析

响应面试验设计与结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

如表2 所示，按照Box-Benhnken 设计进行试验，所得数据由Design Expert 7.13 软件进行分析，建立Y（屎肠球菌B13合成乳酸菌素的相对抑菌效价）关于编码自变量X1（接种量）、X2（培养基初始pH）、X3（发酵温度）的二次多项回归方程：

响应面的回归模型方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression model

对该模型进行方差分析，结果如表3 所示，本试验构建的二次多项模型具有极高的显著性（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.717 4），且模型的相关系数R2=0.998 0，仅有总变异的0.20%不能用此模型来解释，表明该模型与试验拟合良好，自变量与响应值之间存在显著的线性关系，能够描述和预测不同培养条件对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的影响。

由表3 可知：3 个因素中发酵温度对屎肠球菌B13合成细菌素有显著影响；接种量与培养基初始pH 之间、培养基初始pH 与发酵温度之间互作明显，但接种量与发酵温度之间没有互作效应。屎肠球菌B13合成乳酸菌素会受到以上3 个因素的交互影响，且影响程度依次为：发酵温度＞培养基初始pH＞接种量。

2.2.2 响应曲面图及其等高线

接种量和培养基初始pH 值对屎肠球菌B13合成乳酸菌素影响的响应面图及等高线如图4 所示。

图4 接种量和培养基初始pH 值对屎肠球菌B13 合成乳酸菌素影响的响应曲面图及等高线Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between inoculation amount and innitial pH on bacteriocin production

由图4 中的响应曲面可以看出，当接种量固定时，若培养基初始pH 值小于5.5，该菌所产乳酸菌素的效价随起始pH 值的增加而增大；若培养基初始pH 值超过5.5，抑菌活性则随之下降。当接种量在4.5%左右、培养基初始pH 值在5.5 左右时，屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。陈琳等研究表明pH 值较低的培养条件更适于细菌素的合成[16]。其他研究[17]表明屎肠球菌WHE81 分泌的乳酸菌素的最适pH 值为5.0。由此可见最适pH 值可能与菌株个体特性有关。

接种量和发酵温度对屎肠球菌B13合成乳酸菌素影响的响应曲面图及等高线如图5 所示。

图5 接种量和发酵温度对屎肠球菌B13 合成乳酸菌素影响的响应曲面图及等高线Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between inoculation amount and fermentation temperature on bacteriocin production

由图5 中的响应曲面可以看出，当发酵温度固定时，若接种量小于4.5%，该菌所产乳酸菌素的效价随接种量的增加而增大；若接种量大于4.5%，抑菌活性则随之下降。当接种量在4.5%左右、发酵温度在34 ℃左右时，屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。研究结果与Aasen 等[18]研究结果一致。

培养基初始pH 值和发酵温度对屎肠球菌B13合成乳酸菌素影响的响应曲面图及等高线图如图6 所示。

图6 培养基初始pH 值和发酵温度对屎肠球菌B13 合成乳酸菌素影响的响应曲面图及等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between innitial pH and fermentation temperature on bacteriocin production

由图6 中的响应曲面可以看出，当培养基初始pH值固定时，若培养温度小于34 ℃，该菌所产乳酸菌素的效价随温度的提高而增大；若培养温度高于34 ℃，抑菌活性也随之下降。当培养温度在34 ℃左右，初始pH 值在5.5 左右时，屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。前期研究关于菌种合成细菌素的最适温度的报道差异较大，鲁晶晶等[19]发现植物乳杆菌LJ-3产细菌素的最适温度为30 ℃。Leroy 等[20]在研究屎肠球菌RZSC5 时发现，其产细菌素的最适温度为35 ℃，说明细菌素合成的最适温度具有菌株特异性。虽然不同的菌株产细菌素的最适温度不同，但多数研究证明当菌株处于较低的培养温度时反而能获得相对较高的细菌素产量[21]。菌体之所以会生成细菌素很可能是出于对不利环境的应激，因此略低于细菌最适生长温度的培养条件有助于获得更多的细菌素[22-23]。

2.2.3 回归模型的验证

应用Design-Expert 7.1.3 软件求得二次曲面方程的极值，得到：当接种量为4.37%、培养基初始pH 值为5.28、培养温度为32.80 ℃时，屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效价最高，可达5.16×108IU/mL。

为检验响应面法优化的准确性，本试验对优化后的培养条件进行验证，发现实际值（5.32×108IU/mL）与预测值（5.16×108IU/mL）拟合程度高，并对原始培养条件下和优化条件下的乳酸菌素抑菌效价进行对比，结果显示响应曲面优化后的乳酸菌素抑菌效价达到5.32×108IU/mL，较原始培养条件（2.18×108IU/mL）提高了1.44 倍。

3 结论

本试验首先采用单因素法，筛选出接种量、培养基初始pH 值、发酵温度3 种因素对屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效价有较大影响，然后进行响应曲面优化试验，最终确定其最佳培养条件为：接种量4.4%、培养基初始pH 5.3、发酵温度33 ℃，在此条件下，屎肠球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效价高达5.32×108IU/mL，较原培养条件下抑菌效价提高1.44 倍。