GC-MS用于花果香气成分研究进展

张会，郭磊，王军民，谭大聪，华燕

（西南林业大学云南森林资源培育与利用协同创新中心，云南昆明650224）

花果香气成分与花果的质量、加工及营养价值密切相关。香气成分是其能否博得消费者的喜欢、是否是市场主力的主要考察因素。植物香气成分，是一类分子量较小的次生代谢物，在植物学界也称之为精油。目前已知含精油较多的植物有龙脑香科、芸香科、禾本科、樟科、姜科、桃金娘科、木兰科、柏科等。植物的营养器官和生殖器官均有香气成分分布，不同部位含量有所不同[1]。有些植物的根、茎、叶、皮、花或果等可作为天然香料，但花果的香气最为突出，也是最具经济价值的部位，香气成分是其主要特征。研究香气成分，有利于优化品种特性，提高经济效益。

近年来，国内外有许多关于香气成分的研究方法、各种花果的香气成分及其不同品种之间的成分差异的研究[2-4]。香气成分的前处理方法有同时蒸馏萃取法 （simultaneous distillation and solvent extraction，SDE）、超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）、顶空法（headspace，HS）、固相微萃取法（solidphase microextraction，SPME），通常使用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用技术对其进行检测。本文对香气成分的主要研究方法进行对比分析，阐述其用于香气成分的研究特点。同时，总结常见花果及其加工制品的香气成分差异，介绍花香的生物功能，为香气成分的基因分析及其相关研究提供依据。

1 花果香气成分的研究方法

花果香气成分的研究流程主要包括以下5 个方面，样品采集与制备、样品前处理、采集数据、数据处理与分析以及生物学解释。根据研究目的和对象不同采取合适的存放条件，分析含水量较高的挥发性组分时，取样后，先用液氮研磨粉末，低温保存，如黄瓜、番茄、草莓等。挥发性植物代谢谱的采集常采用固相微萃取的前处理方法，非挥发性植物代谢物谱需进行衍生化处理。运用气质联用检测其中代谢物的种类、含量，得到代谢图谱，对原始数据进行处理分析，找出差异代谢物，进行生物学解释。花果香气成分的研究流程可归纳如图1 所示。

图1 花果香气成分的研究流程Fig.1 The analysis flow of aroma components

1.1 前处理方法

同时蒸馏萃取法、超临界流体萃取法、顶空法、固相微萃取法等几种方法均可用于提取香气成分。SDE[2]是Nickerson 和Likens 在1964 年设计的一种将水蒸气蒸馏和溶剂萃取结合起来的分析方法。SDE 的优点是操作简便，香气的回收率和提取率均较高。但由于整个分析过程是在高温密闭的环境下进行，热敏感的香气组分会受到影响，从而导致分析不完全，不能反映原料的完整香气特征。SFE 是指当温度和压力均超过临界点时，作为溶剂的超临界流体将从样品中萃取目标物。该方法的优点是有效保护挥发性物质中的热敏性成分不被破坏，缺点则是工艺要求高，费用大。SPME 和HS 是香气成分研究中最常使用的方法。Arthur C L 等[5]在 1990 年首次应用 SPME，萃取、浓缩同时进行且无需溶剂，使样品的制备变得更加简单。SPME 萃取效率主要取决于几个可优化的因素，如要提取的化合物性质、提取温度、提取时间、纤维的涂层材料以及盐析效果等[6]。SPME 提取技术快速、简便，适用于从水溶液中提取和浓缩挥发性和半挥发性化合物。相对SPME 来说，HS 不使用昂贵的萃取头，直接进样顶部空间的挥发性气体，不足之处则在于没有富集的过程，同样的检测条件，HS 检测到的化合物相对少于SPME。HS 和SPME 的主要区别在于：HS 没有富集样品的过程，而SPME 使用了萃取头富集，检测到的化合物更多。Zhong 等[7]使用SPME 的前处理方法，GCMS 联用技术检测到紫苏中所含挥发性成分单萜、倍半萜、脂肪酸等56 个。

1.2 检测方法

GC-MS 联用技术主要分析易挥发、热稳定、能气化或衍生化后具有挥发性的小分子代谢物[8]。它因其具有较高的灵敏度、分辨率和大量标准谱库而成为目前挥发性成分的主要分析平台之一，常被用于分析农产品中的挥发性和半挥发性代谢物[9]。此外，气相色谱与飞行时间质谱（gas chromatography-time of flight，GC-TOF）结合，使用非靶向分析可获得大量的化学信息，这主要是因为其具有分析物检测速度快和反卷积处理效率高等优点[10]。评价花果品质还有一种感官分析方法，但是感官分析受人的主观意识影响较大，对产品的最终评价将造成不可避免的误差。基于哺乳动物嗅觉和味觉机理的人工电子鼻和电子舌正好能够弥补此不足之处。电子鼻系统由气敏传感器、信号处理模块和模式识别三大部分组成，具有识别气体的能力[11]。与电子鼻结构类似，电子舌的组成也同样分为这三部分。与电子鼻不同的是，电子舌检测的对象是液体，其工作原理与电子鼻类似。电子舌的工作原理是：味觉传感器感受到样品中的不同呈味物质，从而产生电信号；信号调节电路，电信号放大电路；进行模数转换，将这些信号发送至电脑；软件分析，进行模式识别分析；最后做出判断并输出结果[12]。GC-MS 与电子舌结合对花果品质的检测研究较少。Escriche 等[13]采用伏安型电子舌检测不同处理的蜂蜜，经过主成分分析和人工神经网络分析后，对来自不同产地的蜂蜜具有很好的区分度。

2 花果香气成分的物质种类

2.1 花香

花香是观赏植物所具有的重要性状特征，人们不仅仅只在意花的观赏价值给人带来的视觉美感，同时也期望其芳香性状越来越好。随着分析仪器和样品前处理技术的迅速发展，花香研究也进行地比较顺利。桂花、丁香花、白兰花、茉莉花、栀子花等常见园林树木花的挥发性物质已初步鉴定。现将常见植物花香的主要香气成分归纳如表1。

目前，从桂花（Osmanthus frsgrans Lou.）中鉴定到60 多种香气物质[15]。使用GC-MS 联用技术检测白兰花（Michelia alba DC.）所含的香气成分，芳樟醇是其主要香气成分[16]。李丽华等[17]采用HS-SPME/GC-MS 联用技术分析茉莉花（Jasminum sambac L.）的香气成分，分别采用3 种萃取头型号DVB、PDMS、PA，分离出100 多种香气成分，所得主成分基本一致。分别使用动态顶空法和固相微萃取法分离栀子花（Gardenia）的香气成分，用GC-MS 技术分析检测到54 种香气物质[18]。陈奇奇[19]利用顶空进样对枣花（Ziziphus jujuba Mill.）的香气成分进行分析。经系统谱库检索、谱图分析，9 个品种的枣花共鉴定出60 个化合物，蜜蜂罐枣花的4 个器官共鉴定出59 个化合物，不同样品挥发性物质有所差异，但主要成分都是酯类、醛类、酮类、烷烃类。

表1 植物花香的主要香气成分Table 1 The main aroma of plant fragrance

快速的科技发展将花香成分的研究推向了新高度，使得代谢组学与基因组学整合起来。白玉兰（Magnolia Champaca），是一种因花香而出名的树。这些花香广泛应用于香精和香料行业。尽管具有重要的商业意义，但这些花卉中的VOCs 生物合成途径鲜为人知。Savitha 团队[20]结合代谢物和 RNA 序列（RNA-seq）对完全开放的白玉兰进行分析，用顶空法和气相色谱-质谱法联合分析。共鉴定出43 种挥发性有机物，其中46.9%为萜类化合物，38.9%为挥发性酯类，5.2%为苯丙类/苯类化合物。VOCs 详细轮廓谱使得从RNA-seq数据中发现了与花香味生物合成有关的通路和基因。对花和叶中许多与花香合成相关的单基因表达水平的分析表明，大多数基因在花中的表达量高于在叶片组织中的表达量。

虽然国内学者对花香的研究取得了一些进展，但大多仍徘徊于不同品种之间的香气成分区别研究，不同种类植物花香组分的分析，其代谢与合成途径研究很少。近20 年来，国内外研究人员开始研究花香物质的代谢路径及其基因和相关酶的作用机理，了解香气的形成机制，为培育新品种提供理论依据[22]。由于复杂的植物代谢和种属特异性，花香物质代谢机理还有许多问题。例如，一些目标基因的过表达或抑制，并没有对目标代谢产物产生影响。在不同的植物体或转化体中，仍然存在目标基因表达差异大，酶活性高低与目标产物合成及限速酶基因表达有时不一致等问题。因此，植物花香成分代谢途径的基因工程仍然面临着很多具有挑战性的任务，应用基因工程技术对植物花香物质代谢途径进行改良时，应与常规育种技术相结合，稳定花香性状的同时，有效整合优良性状，培育新品种。随着对植物花香物质代谢途径的全面解析、克隆相关基因以及现代生物技术的不断进步，现有植物性状将更加有效地改造，培育出色香型俱佳的观赏植物，构建芳香幽幽的园林，带来可观的经济效益和社会效益。

2.2 果香

随着食品工业对天然风味成分需求的增加以及国际市场对果品品质的要求越来越高，果品香气受到大众的日益关注。果实的挥发性香气化合物多达2 000余种，主要香气成分类别见表2。

表2 常见果实的主要香气成分Table 2 Main aroma components of common fruits

香气成分种类及其含量客观地反映出不同果品所具有的风味特点，是评价其风味的重要指标之一。香气成分会在一定程度上指示食品的营养价值和健康状况[30]，草莓因其具有令人愉悦的香味和营养而世界闻名。研究表明，甜味和复杂风味是“理想”草莓体验的一贯优点[31]。调查研究表明，在草莓中鉴定出300多种香气成分[29]。不同果实的香气由不同的挥发性成分组成，这体现出品种之间的差异性。研究香气成分对提高果实质量、育种及其深加工等均具有重要意义。20 世纪60 年代开始研究果实香气成分，起初多研究葡萄、草莓等常见水果[32]。80 年代重点研究香气物质对水果的感官贡献。然而，由于仪器设备落后，测定结果不准确，限制了其发展。进入90 年代后，随着GC-MS 技术的发展，以及开发了新型香气成分提取方法SPME[5]。国内外在不同果实香气成分的测定方面取得了一些阶段性的成果，香气成分的研究也进行地更加广泛更加深入。在果实的不同发育阶段，香气成分及含量差异较大。张序等[24]研究“红灯”甜樱桃发育过程中香气成分的组分及积累过程，樱桃成熟时，其成熟特征性香气成分见表2。研究“新世纪”、“红丰”两个杏品种所含香气成分，分别鉴定出74 种和72 种[25]。刘胜辉等[27]采用HS-SPME/GC-MS 分析3 个不同品种的杨桃成熟果实。不同沙果品种，香气成分种类及含量不尽相同，“大花红”与“泰山花红”果实香气物质以醇类为主，分别占总含量的79.27%和67.24%；“秋风蜜”、“一窝蜂”、“小花红”和“莱芜花红”的果实香气成分以酯类为主，其含量分别占总含量的98.86%、94.62%、81.35%和 73.56%[33]。研究台农 21、Phuket、Josapine 等6 个菠萝品种挥发物种类。结果表明：MD-2、MacGregor、台农 21、Phuket 以酯类为主，而 Josapine 以萜烯类为主。引自马来西亚的Josapine 与其他5 个品种的挥发性物质差异较大[28]。综上所述，同一果品，不同品种，主要香气物质有相同也有不同，不能一概而论。

结合感官评价和仪器分析，对食品的风味和口感进行研究。采用多元统计分析方法，水果中存在的许多VOCs 对香气和风味有积极的促进作用，能给人留下愉快的印象[34]。在过去的30 年里，草莓育种计划的主要目标是提高农艺表现，从而生产出鲜艳的大型果实。但研究发现其香味才是影响消费者的主要品质性状[31，35]。但只有少数被报道对人类感知到的草莓香气有贡献[36-38]。与其他水果作物一样，生物合成途径、酶和挥发性化合物积累的调控在草莓属中也得到了部分阐明。Goff[30]研究发现果实的挥发性特征取决于遗传（水果种类和品种）、发育阶段和采后因素以及分析技术。Samykanno[39]使用GC×GC-MS 检测两个澳大利亚生长的草莓品种，从中鉴定了94 个化合物。

利用 GC-MS 技术，结合 HS、SPME 或者 HSSPME 等前处理方法进行挥发性成分的研究现已广泛开展。Colinacoca 等[3]建立一种新方法，使用HS-GCMS 检测方法分析洋葱中的挥发性物质，鉴定到18 种挥发性成分并定量分析其中9 种。至今，最为成功的分析技术是 HS-SPME/GC-MS[40-41]。2014 年，Allwood 等[42]提出了一种简单可靠的聚二甲基硅氧烷（poly dimethyl siloxane，PDMS）分析方法。通过主成分分析，在香瓜中检测到58 种VOCs。通过与传统的SPME-GC-MS 分析数据比较，表明高通量PDMS 分析方法对香瓜香气和品质的评价具有很大的潜力。Vrhovsek 等[43]开发并验证一种通用的GC-MS/MS 方法，利用该技术分析苹果、覆盆子和葡萄中的挥发性化合物。主要类别是酯类、醇、单萜类、醛、酮、酸、去甲异丙烯酮、倍半萜、吡嗪和醚，苹果中的69 种化合物、葡萄中的122 种和覆盆子中的42 种。该方法易于推广到其他水果中的挥发性化合物，因此可广泛应用于水果香气领域的定性或定量研究。

2.3 加工制品的香气成分

由植物花和果制成的加工品尤其之多，最常见的莫过于葡萄酒。葡萄酒的香气成分研究较早。早在上世纪五十年代，Bayer 等[44]首次采用气相色谱技术对葡萄酒的挥发性组分进行了研究，并成功鉴定出了一些酯类和高级醇物质。色谱质谱等现代分析方法的发展，为挥发性物质的研究提供了重要的分析手段。目前，从葡萄酒中鉴定出的挥发性成分大约有800 多种，主要包括萜烯类、酯类、内酯类、醇类、有机酸类、挥发性酚类和杂环类化合物等[45]。近年来，对于葡萄酒的香气成分研究主要集中于不同制作方法和不同采摘期，区分葡萄酒香气成分。李娜娜等[46]研究表明，3 个采收期，蒸馏酒品种最好的是采于8 月18 日的葡萄制成；葡萄酒质量最好的是9 月5 日采收的。因此，制作不同的加工品，需研究其最佳采收原料时间，使得香气质量最好。除了葡萄酒还有人用草莓酿造草莓酒，HSSPME/GC-MS 分析草莓酒的香气成分，共鉴定出32 种成分，主成分为乙醇、异戊醇、正丙醇、十六酸2-甲基丙酯等，主要为醇类和酯类[47]。苹果酒香气是评价苹果酒质量的重要指标，其香气成分是影响苹果酒品质的主要影响因素。苹果酒的香气成分主要是一些高级醇类、酯类、内酯、缩醛、萜烯和低级脂肪酸等微量成分[48]。

3 花香的功能

植物花朵的芳香来源于花瓣或花被释放的多种挥发性香气成分。花香挥发物的释放不仅是植物引诱昆虫授粉、受精的重要表达信号，也是植物对食草生物主动防御的适应机制。而且，植物的花香能使人心情愉悦，是表征观赏植物的重要指标。大自然中的许多植物花朵都能散发出香气，许多香气成分混合在一起形成了花香，不同的香气成分及其含量差异构成了其独特的显著特征。普遍认为花香有两种功能：吸引昆虫授粉以及抵御昆虫侵害[49]。许多种类的植物不能进行自花授粉，需要吸引昆虫进行授粉从而繁殖。花朵漂亮的外形和艳丽的色彩与花香一起作用吸引昆虫[50]。根据花香特性，昆虫访问具有它感兴趣花香的植物花朵。另外一些花朵通过其挥发出来的气味抵御或避免昆虫对自己的伤害，或者当植物被细菌真菌感染后，花香作为信号激起免疫反应进行自愈。

植物花朵所具有的挥发性物质是其次生代谢产物，在植物的传粉过程中担任着至关重要的角色。开花过程中，香气成分的种类、含量及其比例对引诱传粉者觅食影响较大[51]，并为花香代谢与调控提供理论依据[52]。赵印泉等[53]以“三轮玉蝶”梅花为材料，使用HS-SPME/GC-MS 联用技术，研究梅花香气物质的时空动态变化，对5 个不同阶段的花朵及不同花器官释放的香气成分进行检测。推测，在开花的第4 阶段，花萼、雌蕊群和花盘释放乙酸己酯含量较高，丁子香酚含量较低，这或许是引诱蜜蜂觅食的重要信号。

4 小结与展望

有综述表明[29]，不同的前处理方法，提取草莓中的香气成分，重现性较差。在其整理的25 项研究中，没有一种物质在所有的研究中均被检测到。而且，有67%的物质只在一项研究中所检测到。前期总结花果香气成分的前处理方法，例如同时蒸馏萃取法、超临界流体萃取法、顶空法、固相微萃取法，每个方法各有优缺点。综合比较，SPME 萃取效果最佳，能检测到较多香气成分，但由于其萃取头的纤维材料制作不尽完全相同，且随着时间的推移，使用程度对其纤维有所损伤，因而，同一处理之间的数据重复性较差，且不能对香气成分进行完全定量。所以，在今后的研究中，为减少试验误差，找到一种重现性稳定性较好的研究方法至关重要。分析花果香气成分的研究很多，但迄今为止，仍然不存在一种方法能够适用于多种材料。目前，对高复杂混合物的大规模分析采用了一系列的综合技术和方法。近年来，有报道称，利用基因工程的方法可以改良植物花果香气，比如倍半萜合成酶基因[54]、法呢基焦磷酸合成酶基因[55]等花香基因。目前，对花果香气成分的研究已取得一些进展。但大多只研究不同花果种类、不同品种之间的香气物质及含量差异，而对香气的形成过程及相关酶的作用机制研究很少。应加大对改善花果的香气及提高花果质量的研究。此外，香气是通过人体嗅觉器官感知而评价的。因此，香气物质的鉴定须结合感官评价，才会使香气成分的研究更有意义。在未来，应该越来越重视气相色谱与感官分析相结合。