响应面法优化坛紫菜抗氧化肽酶法制备工艺

梁杰，邓波，刘涛，汪秀妹，赵晓旭，汪少芸

（1.莆田学院环境与生物工程学院，福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建莆田351100；2.福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）

紫菜是重要的海洋经济海藻，品种丰富，主要以坛紫菜、条斑紫菜最为常见[1]。早在二十世纪中叶，我国长江以南就实现了坛紫菜的人工养殖[2]。坛紫菜是福建特有的栽培品种，以营养丰富、滋味鲜美著称，富含蛋白质、多酚、多糖、矿物元素等，素有“营养宝库”的美称[3]。坛紫菜可多次收割，4 次收割以后的残次紫菜俗称为末水紫菜，末水坛紫菜由于口感、色泽较差，常被作为农产品下脚料随意丢弃甚至腐烂在海水中，造成极大的资源浪费和环境污染[4-5]。据报道，2016 年福建省紫菜年产量已达到6.6 万吨[6]，末水紫菜可占10%以上，虽然末水坛紫菜食用价值低，但仍然还有丰富的营养成分和药用价值，如何从废弃坛紫菜中提取有效成分以提升其经济附加值具有重要的经济意义[7-9]。

自由基（free radical）是化合物分子受到外界环境如光、热、辐射等作用导致共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团，是需氧型动物机体内正常生理代谢产生的如 O2-、OH-、NO 等基团[10]，机体内处于动态平衡的自由基对人体有益，它们在帮助传递维持生命活力的能量的同时被用来杀灭细菌和寄生虫，承担重要的生物学功能。当机体内自由基的产生和清除无法平衡时，自由基就会攻击生物体细胞组织造成损伤，对核酸、蛋白质、脂质、酶、生物膜及机体循环和免疫系统进行破坏，干扰体内新陈代谢，以致产生更多自由基，恶性循环，导致衰老、炎症和各种疾病，如老年痴呆、癌症等[11]，甚至造成死亡。

本文以末水坛紫菜为原料，以DPPH 自由基清除率和抗氧化肽得率为指标对其进行酶解，筛选最适的酶制剂。以抗氧化能力和得率为指标，借助超声波技术辅助提取，通过单因素和响应面试验确定最佳酶解工艺，得到具有较强抗氧化能力的水解肽并对其性质进行分析，包括氨基酸含量和分子量分布组成，以期为末水坛紫菜高值化利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料

坛紫菜：福建莆田沃尔玛超市。

1.1.2 试验试剂

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶：南京都莱生物技术有限公司；其它化学试剂均为分析纯。试验过程使用均为去离子水。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-10N 型冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份公司；UV2550 紫外/可见分光光度计：日本岛津公司；DGG-9053A 电热鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；FW-100 高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；BCD-208K/A 型冰箱：中国海尔集团；MDFU333 型超低温冰箱：日本三洋电机株式会社；STARTER-2100 型精密数显酸度计：奥豪斯仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫菜活性肽制备方法

1.3.1.1 酶解工艺

干坛紫菜→剪碎用粉碎机打至细粉状→加水搅拌至完全溶解→最佳酶解条件，充分酶解→100 ℃下灭酶10 min→静置冷却后10 000 r/min 速率离心分离10 min，取上清液→酶解液，冻干备用

1.3.1.2 筛选最适酶制剂

选用5 种对坛紫菜酶解效率较高的酶制剂，以DPPH 自由基清除率和抗氧化肽得率为参考评价酶解效果，筛选最适蛋白酶。各酶的最适条件见表1。

表1 蛋白酶最适pH 值和温度Table 1 Suitable hydrolysis pH value and temperature for proteases

反应初始条件为：取0.25 g 紫菜粉末加入50 mL 的蒸馏水，分别在最适酶解条件水解紫菜粉末，酶用量为10 000 U/g，反应10 h 后，灭酶活，酶解液冻干，测定。

以多肽的得率和酶解产物DPPH 自由基清除率为指标，选择最佳酶作为后续试验的工具酶。

1.3.2 DPPH 自由基清除率的测定

参照文献[12]的方法并加以改进测定DPPH 自由基清除率。将浓度为0.002 g/mL 的2 mL 样品溶液加入试管中，在试管中加入浓度为0.004 g/L 的2 mL DPPH·无水乙醇溶液，放置在黑暗环境下反应30 min，取出来后在517 nm 的波长下测定吸光度，记为Ai；再取浓度为0.002 g/mL 的2 mL 样品溶液与2 mL 无水乙醇溶液混合，操作同上，其吸光度记为Aj；再取2 mL无水乙醇溶液与浓度为0.004 g/L 的2 mL DPPH·无水乙醇溶液混合，操作同上，吸光度记为Ao；重复3 次。酶解产物的DPPH 自由基清除计算公式如下：

1.3.3 紫菜多肽得率的计算

准确称量酶解反应前的紫菜样品粉末重量，记为Ae；酶解上清液冷冻干燥，准确称量品重量并记录，记为At，计算多肽得率的公式为：

1.3.4 单因素试验

参考文献[13]并在前期预试验的基础上，以多肽得率和DPPH 自由基清除率为指标，设置初始条件为：pH7.0、底物浓度5%、温度50 ℃、酶用量10 000 U/g，分别考察酶解温度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶解时间（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h）、酶用量（5 000、10 000、15 000、20 000、25 000、30 000 U/g）、底物浓度（3 %、4 %、5%、6%、7%、8%）等条件对酶解效果的影响，确定各因素的适宜水平范围。

1.3.5 响应面试验

通过分析单因素试验结果，选取了酶解温度（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）和底物浓度（D）这 4 种因素进行Box-Behnken 试验设计。以上述4 个因素为自变量，以酶解得到抗氧化肽的DPPH 自由基清除率（Y）为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验因素与水平设计见表2。

表2 Box-Behnken 因素水平设计表Table 2 Factors and levels of the Box-Behnken experimental dsign

1.4 数据处理

试验数据使用Excel2013，Design Expert8.05 软件绘图，每组试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 最佳酶制剂筛选

选择酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、胰蛋白酶对紫菜进行酶解，反应初始条件设置为：底物浓度5%、酶用量10 000 U/g，酶解条件如表1所示为各蛋白酶的最适条件。以酶解产物的DPPH 自由基清除率和多肽得率为指标筛选酶解坛紫菜的最佳工具酶，结果如图1 所示。

当各种蛋白酶分别处于各自最适温度、pH 值，且底物浓度和加酶量一致的条件下，各种蛋白酶对紫菜蛋白的酶切位点和酶解产物性质并不相同，酶解效果具有显著的差异性[14]，各种酶解产物抗氧化能力强弱依次为：中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞胰蛋白酶＞纤维素酶，中性蛋白酶酶解产物DPPH 自由基清除能力最强为（43.25±0.14）%。虽然纤维素酶酶解产物多肽得率最高（70.42±0.12）%，但酶解产物对DPPH 自由基清除率较低，不适合作为后续研究的工具酶。中性蛋白酶是一种非特异性内切酶，对海洋生物的酶解效率高，酶解切割肽段小，酶解最彻底。综上所述，选择中性蛋白酶为最适工具酶进行后续酶解工艺的研究，这与王小慧等对坛紫菜筛选最佳蛋白酶的研究结果一致[9，15-17]。

图1 最佳工具酶的确定Fig.1 Fix the most suitable protease

2.2 单因素试验结果

各因素对酶解效果的影响见图2。

图2 各因素对酶解效果的影响Fig.2 Effects of different factors on eymohydrolysis

2.2.1 酶解温度的确定

由图2A 可知，酶解产物的DPPH 自由基清除率随着温度的升高先增大后降低，当酶解温度为40 ℃时，DPPH 自由基清除率和多肽得率到达最大值（65.06±0.32）%、（68.02±0.58）%，由于高温会使蛋白酶的空间结构发生改变，造成酶活降力降低，影响酶促反应的进行，酶解产物的活性成分降低[18]，选择40 ℃为最佳酶解温度。

2.2.2 酶解时间的确定

由图2B 可知，多肽得率随着时间的增大呈上升趋势，酶解时间为4 h 时产物的DPPH 自由基清除能力最强为（72.67±0.27）%，此时继续延长酶解时间产物的抗氧化能力开始下降，酶解12 h 多肽得率最高。综合考虑时间成本和经济成本的实际情况，选择最佳酶解时间为4 h。

2.2.3 酶用量的确定

由图2C 可知，在一定范围内多肽得率随酶用量的增加而增加，当酶用量达到30 000 U/g 时，多肽的得率达到最大值（80.84±0.45）%。随着加酶量的增加，增加了中性蛋白酶与紫菜蛋白的有效结合，提高了酶解效率，当加酶量过饱和时，酶解进程减缓[19]。DPPH 自由基清除率在酶用量达到20 000 U/g 时达到最高值（74.44±0.32）%。综合考虑，选择酶用量 20 000 U/g 为最佳水平。

2.2.4 底物浓度的确定

由图2D 可知，随着底物浓度提高多肽得率和DPPH 自由基清除率都相应提高，当底物浓度为4%时，清除率到达最高值（68.55±0.64）%，此时多肽得率为（59.20±0.31）%已接近最大值，此后底物浓度继续提高酶解产物的自由基清除率反而下降，这是由于底物浓度太高导致酶促反应体系过于黏稠，不利于酶的与底物有效结合，影响蛋白酶活力的释放[20]。综上所述，选择底物浓度4%为最佳水平。

2.3 响应面分析

2.3.1 响应面结果

根据单因素试验结果，选取了酶解温度（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）和底物浓度（D）这 4 个对酶解法关键的工艺参数为自变量，以酶解得到抗氧化肽的DPPH 自由基清除率（Y）为响应值，进行Box-Behnken试验设计。试验结果见表3。

表3 响应面试验结果Table 3 Results of response surface

2.3.2 响应面方差分析

运用Design Expert8.06 软件对数据分析并进行多元回归拟合，得到的方程为Y=85.4+0.33A-0.03B-0.51C-9.51D+1.36AB+1.29AC-2.61AD+2.09BC+2.22BD+8.3CD-1.17A2-6.79B2-5.7C2-6.88D2。方差分析见表4。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

回归方程的模型P＜0.000 1，F=24.46，说明模型差异性显著，失拟项的误差值P 为0.266 7＞0.05，失拟不显著，回归方程的拟合度高，模型相关系数R2=0.960 3，调整系数R2adj=0.920 6，该模型可以解释92.06%的响应值变化，该模型的DPPH 自由基清除率的实测值和预测值良好，可用来分析和预测酶解法制备坛紫菜抗氧化肽的DPPH 自由基清除率。

2.3.3 响应面交互作用分析

响应曲面坡度陡峭和等高线呈椭圆形表明两因素交互作用影响显著，若曲面坡度平缓且等高线呈圆形则表示酶解条件发生变化时对响应值变化影响不显著[21]。各因素之间的交互作用如图3 所示，响应曲面陡峭，等高线呈椭圆形，表明酶用量与底物浓度之间的交互作用影响显著。

2.3.4 最佳酶解条件的确定和验证

采用DesignExpert8.05 分析，最佳酶解条件为：酶解时间3.59 h、酶解温度47.33 ℃、加酶量16 362.13 U/g、底物浓度3.0%、pH7.0 时，DPPH 自由基清除率可以达到92.61%，结合实际试验条件设定酶解工艺参数：酶解时间3.6 h、酶解温度47 ℃、酶用量16 362 U/g、底物浓度3.0%、pH7.0。在该工艺下做3 组平行试验，测得坛紫菜抗氧化肽的DPPH 自由基清除率达到（91.83±0.80）%，与预测值相差0.84 %。表明该响应面模型可靠。

图3 各因素交互作用的响应面图Fig.3 Response surface plots showing the effects of various factors

3 结论

结果表明中性蛋白酶为末水坛紫菜最佳水解酶制剂。采用响应面试验优化其最佳酶解条件为：酶解温度47 ℃、酶解时间3.6 h、酶用量16 362 U/g、底物浓度3.0%、pH7.0。此条件下酶解末水坛紫菜制备的抗氧化肽DPPH 自由基清除率高达（91.83±0.81）%，较未优化前的DPPH 自由基清除率提高52.90%，表明该优化模型可靠，末水坛紫菜水解肽具有良好的抗氧化能力[22]。本研究为末水坛紫菜高值化利用提供了理论依据和试验基础，具有广阔的经济效益和良好的环境效益。