非洲冰菜组培苗防止玻璃化及快繁体系优化研究

王兴翠，张晓艳，裴华丽，彭佃亮

(1.潍坊科技学院 山东省高校设施园艺实验室，山东 寿光 262700；2.山东省寿光市农业局，山东 寿光 262700)

optimization

冰菜(MesembryanthemumcrystallinumL.)，也称冰叶日中花、非洲冰草，番杏科日中花属，双子叶一年矮生肉质草本植物.原产南非，耐干燥、耐盐性较强，因其茎叶外表为植物分泌的一种偏碱性的晶状物，看似像有一层冰，故名为冰菜[1].茎叶内含有大量的肌醇类、β胡萝卜素、维生素K、脯氨酸及各类矿物质等机能性成分，是一种具有健康美容效果的机能性蔬菜.因其营养价值较高，口味独特，已越来越受关注[2].近年来，国内关于冰草的研究报道主要集中在引种栽培方面[3-5]，在植物的耐盐性研究上也有报道并被作为生物样本收集[5].栽培生产上采用种子种植存在诸多限制问题：国产冰菜种子为进口杂交一代种子繁育的二代甚至三代种子，虽价格较低，但植株抗性弱、商品性差；进口种子可解决以上问题，但价格较高；冰菜种子极为细小，拱土能力较弱，经常出现无法出土腐烂、发芽率低的现象.组培苗繁殖系数大，既保证了其优良性状又可加快繁殖速度，但前人利用冰菜子叶节、叶片及种子萌发获得的顶芽等为外植体诱导不定芽研究发现其再生频率较低[6-7].为此，笔者以田间生长旺盛的冰菜幼嫩茎段及顶芽为试材建立其快繁体系，旨在筛选出非洲冰菜最佳的高频快繁配方，为冰菜的大规模生产提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料由潍坊寿光鲁寿绿园有机蔬菜公司提供，选取田间生长的健壮的冰菜幼嫩茎段及顶芽作为初始接种材料.

1.2 试验设计与方法

1.2.1 外植体杀菌消毒

将田间生长健壮的冰菜切割成2 cm 左右茎段(带1个腋芽)及顶芽，分别用70%的乙醇(30，40，50 s)和0.1%的升汞(3，4，5 min)进行不同时间组合的消毒处理，然后，将其接种到无激素的MS基本培养基中，每种处理接种60个外植体，分3次重复，15 d后统计并分析.

1.2.2 冰菜初代培养及玻璃化试管苗的控制

根据1.2.1试验结果，冰菜外植体经最佳消毒处理后，接种到添加琼脂(6，8，10 g·L-1)或氯化钠(3，5，7 g·L-1)的MS培养基中，每种处理90个外植体，分3次重复.

1.2.3 冰菜不定芽继代增殖快繁培养

选取长势良好、健壮的冰菜试管苗，切成1.5 cm左右并去除下端叶片，接种到添加不同浓度激素配比的MS不定芽分化培养基上，试验采用二因素随机区组设计，试验A因素为NAA浓度，分别为0.05(A1)，0.1(A2)，0.2(A3)mg·L-13个水平，B因素为6-BA浓度分别为0.5(B1)，1.0(B2)，2.0(B3)，3.0(B4)mg·L-14个水平，共计12种处理.每种处理90个外植体，分3次重复.定期观察记录冰菜的不定芽分化状况，并统计分析.

1.2.4 冰菜不定芽生根诱导

将分化的不定芽切取单株，以MS和1/2MS培养基为基本培养基，分别接种到添加不同浓度激素NAA(0.1，0.3，0.5 mg·L-1)，IBA(0.1，0.3，0.5 mg·L-1)的生根培养基上，每种处理接种90个外植体，分3次重复.观察并统计各处理的生根情况.

1.2.5 培养基与培养条件

以上试验，除试验1.2.2外，培养基均添加8 g·L-1琼脂、30 g·L-1蔗糖、5 g·L-1NaCl，1 mol·L-1的NaOH调节pH为5.8，121 ℃，高压灭菌21 min.在(25±2) ℃、光照条件为(2 000 lx)16 h·d-1的条件下进行培养.

1.2.6 数据统计与分析

污染率(%)=污染的外植体数/接种的外植体总数×100；

成活率(%)=成活的不定芽数/接种的外植体总数×100；

玻璃化苗发生频率(%)=玻璃化苗发生数/丛生芽总数×100；

不定芽分化率(%)=分化不定芽外植体数/接种外植体总数×100；

不定芽分化指数=不定芽分化总数/已分化外植体个数；

生根率(%)=已生根不定芽个数/不定芽接种总数×100.

试验所得数据采用Excel 2007进行初步整理，采用DPS15.10进行方差分析，其中多重比较及交互效应采用Duncan新复极差法.

2 结果与分析

2.1 消毒时间对冰菜无菌苗获得的影响

经观察发现，冰菜接种3 d后开始生长，但生长15 d后开始出现玻璃化.升汞和70%乙醇对冰菜外植体的灭菌效果列于表1.

表1 升汞和70%乙醇对冰菜外植体灭菌效果的影响

注：表中同列数值后不同大写字母表示处理间差异极显著(α=0.01)，不同小写字母表示处理间差异显著(α=0.05).

由表1可知，杀菌时间不同导致冰菜幼嫩茎段杀菌效果及对其生长的影响不同.最适的消毒时间为0.1%升汞消毒5 min，70%乙醇消毒40 s，成活率达98.3%(接种15 d统计).

2.2 不同浓度琼脂及NaCl对冰菜试管苗玻璃化的影响

不同浓度琼脂及NaCl对冰菜试管苗玻璃化的影响状况列于表2.

表2 不同浓度琼脂及NaCl对冰菜试管苗玻璃化的影响

注：表中同列数值后不同大写字母表示处理间差异极显著(α=0.01)，不同小写字母表示处理间差异显著(α=0.05).

由表2可以看出，随着培养基添加琼脂浓度的增加，冰菜试管苗玻璃化程度呈下降趋势，添加8 g·L-1和10 g·L-1的琼脂较添加6 g·L-1琼脂的冰菜试管苗玻璃化率分别降低7.8%和10.5%，但后者植株长势弱，植株下部叶片黄化现象严重.单独添加NaCl时，冰菜试管苗玻璃化的发生率同单独添加琼脂有相似的变化趋势，当NaCl为7 g·L-1时，虽然冰菜植株玻璃化率最低为10.0%，但与NaCl为5 g·L-1时没有显著差异，且长势弱，叶片黄化严重；结合植株生长状况综合考虑，NaCl为5 g·L-1时效果最好.后期补充试验表明，同时添加8 g·L-1琼脂和5 g·L-1的 NaCl，冰菜试管苗玻璃化的发生率会显著降低，仅为3.3%，且植株长势良好，叶片展开，叶色浓绿，植株表面冰晶明显，故在该试验条件下该培养基最有利于防止冰菜试管苗玻璃化.

2.3 不同浓度激素对冰菜不定芽诱导分化的影响

探讨不同浓度的激素NAA(A因素)和6-BA(B因素)对冰菜不定芽诱导分化的影响，结果列于表3，4.

表3 冰菜不定芽分化率及分化指数差异的方差分析

表4 不同处理间冰菜不定芽分化率和分化指数差异的多重比较

注：表中同列数值后不同大写字母表示处理间差异极显著(α=0.01)，不同小写字母表示处理间差异显著(α=0.05).

通过试验观察，添加较低浓度的6-BA 和NAA，冰菜试管苗叶色呈淡绿色，叶片较宽；而添加高浓度的6-BA 和NAA，冰菜试管苗叶片变窄.由表3可知，NAA浓度(因素A)和6-BA浓度(因素B)显著影响冰菜不定芽分化，且A、B两因素互作对不定芽分化率和分化指数有极显著影响.由表3～4可以看出，继代诱导增殖培养中6-BA较NAA对冰菜不定芽增殖作用较大，相同6-BA浓度水平下，随着NAA浓度的增加，冰菜不定芽分化率和分化指数基本呈现逐渐降低的趋势.当6-BA浓度为2.0 mg·L-1、NAA浓度为0.1 mg·L-1时，冰菜不定芽分化率为97.8%，分化指数较高为9.6.

2.4 不同培养基及不同浓度激素对诱导冰菜生根的影响

不同培养基及不同浓度的激素对冰菜生根的诱导结果列于表5.

表5 不同培养基及不同浓度的激素对冰菜试管苗生根的诱导作用

注：表中同列数值后不同大写字母表示处理间差异极显著(α=0.01)，不同小写字母表示处理间差异显著(α=0.05).

由表5可知，以MS培养基为基本培养基，随着添加NAA或IBA浓度的增加，冰菜试管苗的生根率、株平均根数均呈现先升高后降低的趋势.添加相同浓度的NAA或IBA，冰菜在1/2MS培养基上试管苗的诱导生根状况与MS培养基上有相似的变化规律，但前者诱导生根效果好，表现为当IBA为0.3 mg·L-1时，生根率最高可达95.6%，株平均根数多达13.6条，根长较长.

3 讨 论

3.1 不同浓度琼脂及NaCl对试管苗玻璃化的影响

外植体的生长状况、培养环境条件、培养基成分等均可影响试管苗玻璃化的发生[8].凝胶力强度的变化受培养基中琼脂浓度的影响，其大小影响培养基水势及水分供应状况[9]，提高培养基的琼脂浓度，有利于控制玻璃化苗的发生[10].笔者的试验证实，适当增加培养基中琼脂浓度能够降低冰菜试管苗玻璃化的发生，与陈思等对冰菜的研究结果不尽相同，但两试验均发现添加一定浓度的NaCl能有效控制冰菜试管苗玻璃化的发生[11].

冰菜作为一种聚盐性真盐生植物，一定量的盐分是促进植株生长发育的关键因素[12].研究发现，CAD和乙烯在胁迫条件下是细胞伸长必不可少的因素，冰菜在500 mmol NaCl环境下其真叶的CAD的积累与乙烯的增加呈正相关关系[13]，培养基中适度添加NaCl有利于冰菜的生长[14].Van den Dries等[15]认为，拟南芥玻璃化苗的发生是由于质外体超度含水干扰呼吸作用的电子传递引发氧化胁迫导致；在蓝莓[16]和石竹[17]玻璃化试管苗的研究中也发现玻璃化严重程度与抗氧化酶系统失衡及活性氧代谢异常呈正相关关系.研究发现，冰菜在低浓度盐溶液中能够迅速提高其体内的渗透调节物质的含量及抗氧化酶的活性[18]，冰菜细胞悬浮培养时，一定的盐胁迫可使PEPCase潜在活性和苹果酸含量增加[19].综合以上观点发现，真盐生植物的正常生长离不开一定量的Na+存在，低浓度的NaCl使植物体内积累的渗透调节物质增多、抗氧化体系的活性增强，能够有效防止氧化胁迫发生，从而在组织培养时减少玻璃化苗的产生.也有研究认为，冰菜作为一种C3/CAM可转换型植物，试管苗是否玻璃化与冰菜进行C3植物光合作用或通过CAM途径进行光合作用所积累的产物不同有关.有关NaCl如何有效控制冰菜试管苗玻璃化发生的生理机制需要进一步试验进行数据支持及论证.

3.2 不同浓度的激素配比对冰菜不定芽分化的影响

植物组织培养再生快繁体系建立成功的关键是不定芽的诱导和增殖，而增加幼芽的增殖数量和速率是再生体系中重要的一步[20].不同植物的不同外植体、生长调节物质的种类及配比控制不定芽或丛生芽的形成与增殖，6-BA对细胞分裂和诱导芽的分化具有重要促进作用[21]，冰菜带子叶的顶芽为外植体，其最适宜增殖的培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA[11].从试验结果得出，非洲冰菜不定芽分化的最适培养基为添加2.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA的MS培养基，冰菜不定芽分化率为97.8%，分化指数高达9.6，且植株叶色正常，生长旺盛，与前人研究结果不同的原因可能是冰菜前期培养及外植体的选择不同.

3.3 不同培养基及不同浓度的激素对诱导冰菜不定芽生根的影响

NAA、IAA和IBA能诱导并促进根的生长，是植物组织培养中广泛应用的诱导不定根的外源激素，但添加的浓度过高会起反作用；生根培养对基本培养基的类型要求不严，但培养基若N，P，K盐含量较高则会抑制根的发生，将盐浓度适当稀释或降低至更低水平有利于根的诱导与发生[20].笔者的试验结果显示，接种20 d时不添加任何激素的培养基上冰菜不定芽发根率较低，添加NAA和IBA的培养基上冰菜不定芽生根率较高，根生长较旺，1/2 MS培养基添加0.3 mg·L-1IBA时，生根效果最好.该结果与Michael及陈思等[7,11]研究得出的冰菜在无激素MS培养基中生根率达100%，在有NAA存在时生根情况不理想的结果不一致，其原因可能与统计时间较早及前期初代接种、诱导增殖时添加外源生长调节剂浓度配比不同导致冰菜内源激素变化引发诱导生根状况不同有关，同时证实了添加适当浓度配比的外源生长调节剂有利于诱导冰菜不定芽提前生根.

4 结束语

冰菜组培苗生长情况见图1所示.

(a)～(c)为MS培养基分别添加6，8，10 g·L-1琼脂时冰菜生长情况；(d)～(f)为MS培养基分别添加3，5，7 g·L-1 NaCl时冰菜生长情况；(g)为MS培养基添加8 g·L-1琼脂、5 g·L-1 NaCl时冰菜生长情况；(h)为冰菜不定芽分化增殖；(i)为冰菜诱导生根时根的生长状况.图1 不同培养基中冰菜组培苗的生长状况

笔者利用田间生长旺盛的幼嫩冰菜茎段及顶芽，通过调整培养基中琼脂、NaCl及激素浓度的配比，克服了冰菜在组培过程中玻璃化的问题，建立了稳定的快繁体系.实验结果显示，用70% C2H5OH+0.1% HgCl2分别处理40 s，5 min时，茎段或茎尖的成活率最高；MS培养基添加2.0 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、8 g·L-1琼脂和5 g·L-1NaCl时，冰菜试管苗玻璃化发生率最低，植株叶色正常，生长旺盛，植株表面冰晶明显，且不定芽分化指数可达9.6；1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA培养基最有利于试管苗生根，且侧根较多.