南亚实蝇气味结合蛋白家族基因的筛选及克隆验证

杜迎刚，季清娥，赖钟雄

(1.潍坊科技学院 山东省高校设施园艺实验室，山东 寿光 262700;2.福建农林大学 亚热带果树研究所，福建 福州 350002；3.福建农林大学 植保学院，福建 福州 350002)

南亚实蝇Bactroceratau(Walker)，属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidea)果实蝇属(BactroceraMacquart)，为害丝瓜、南瓜、苦瓜等13种瓜类，柑橘、杧果等共计70多种热带和亚热带瓜果，在中国大陆地区主要分布于广东、广西、海南、福建、云南、贵州、四川、湖北、浙江、江西等地，且为害面积逐年扩大，加上其抗逆性强，个体食量大，发育历期短，产卵期长，给当地的水果和蔬菜生产造成巨大经济损失[1-2]，甚至在很多地区其危害已超过橘小实蝇B.dorsalis(Hendel)和瓜实蝇B.cucuribitae(Coquillett).

嗅觉在昆虫寄主定位与选择、产卵等行为中发挥着感知寄主植物挥发物、昆虫信息素等气味信息物质的重要作用.对昆虫的嗅觉识别进行有效干扰，是实现害虫可持续治理极有潜力的一条途径[3].这种方法从很久以前在实蝇防治和监控上就已发挥着重要作用[4]，在很多地区甚至是唯一的防治措施.但在防治过程中发现引诱剂(主要指甲基丁香酚(methyl eugenol，简称ME)和诱蝇酮(cuelure，简称CUE)这两种副信息素[4])取食经历会对正常实蝇、辐照不育实蝇的交配行为和其对引诱剂的趋性行为产生很大影响[5-6].还有，引诱剂在野外开放环境条件下诱集不到雌蝇，但在室内笼中却诱集到15%左右的雌蝇[7-8].为科学指导引诱剂在实蝇监控和防治上的应用，笔者首次以对两种主要实蝇类昆虫引诱剂——甲基丁香酚和诱蝇酮都具趋性反应的南亚实蝇[9]为研究对象，对其气味结合蛋白(odorant-binding protein，简称OBP)整个家族基因进行筛选和克隆验证.

1 材料与方法

1.1 材 料

南亚实蝇为福建农林大学益虫研究所2013年建立的室内大量饲养种群，初始种群采自漳州，为害丝瓜，该实验所用种群为同地点同类寄主上野生虫源连续复壮3次后的虫源.转录组数据库为该种群不同状态下(正常饲养、辐照处理、CUE/ME诱导的南亚实蝇在1日龄(对ME有触角电位反应，但没趋性[7])、5日龄(对ME开始有趋性反应，但性未成熟)、10日龄(性成熟、交配前后)、17日龄(产卵后)、19日龄(部分实蝇开始出现二次交配))的混合样品，委托“北京百迈客生物科技有限公司”建立合格数据库[10].用于基因克隆的RNA为转录组测序剩余样品.

1.2 方 法

1.2.1 气味结合蛋白相关基因的筛选

用OBP/odorant-binding protein，PBP/pheromone-binding protein，ABPX /antennal-binding protein X，OB-PRPs /OBP-like/odorant binding protein-like为关键词在转录组注释数据库中进行unigene筛选，将这些候选unigene序列与NCBI登陆的相关序列进行比对分析，初步筛选出南亚实蝇OBPs序列.

1.2.2 引物设计与合成

基于初步筛选出的南亚实蝇OBPs序列，各设计一对3′端引物和一对5′端引物，所用引物均为北京六合华大基因科技股份有限公司合成，见表1.

表1 南亚实蝇OBPs基因克隆的引物列表

续表1

续表1

1.2.3 基因克隆

以转录组测序剩余的RNA为模板，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas, EU)试剂逆转录的cDNA用于保守区及3′非编码区(3′UTR)的扩增；用SMARTTMRACE cDNA Amplification kit(Takara,China)试剂逆转录的cDNA用于5′非编码区(5′UTR)的扩增.所用PCR体系为25 μL，扩增程序和体系参照林丽霞等[11]的方法，退火温度根据引物的Tm值做适当调整，延伸时间按照1 kb需1 min的原则根据目的片段长度进行调整.PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳验证后，用EzgeneTMGel/PCR Extraction kit(BIOMIGA)试剂盒进行目的条带的回收纯化，然后连接T载体，转化后的大肠杆菌涂布于含100 mg·L-1氨苄霉素的 LB培养基中37 ℃黑暗倒置培养约12 h后，挑取单克隆摇菌后以M13F、M13R为引物进行PCR检测，选取阳性克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序.

1.2.4 序列分析和进化树构建

对测序得到的基因序列进行Blastx比对去载体，用 DNAMAN 6.0软件拼接后，得到该基因的 cDNA全长.然后用DNAMAN软件对获得的OBPs序列进行分析.

对NCBI、公共数据库进行检索，下载黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、瓜实蝇B.cucuribitae、地中海实蝇Ceratitiscapitata、橘小实蝇B.dorsalis已公开发表的OBPs序列，用MEGA 5.0的neighbor-Joining方法构建OBPs家族的系统进化树.

2 结果与分析

2.1 南亚实蝇OBPs的克隆鉴定

转录组数据库搜索共得到OBPs候选基因32条，进一步克隆验证得到OBPs家族基因cDNA 全长26条，见表2.OBPs的典型特征是在二级序列中存在形成 3 对二硫键的6 个保守的半胱氨酸(Cys)残基[12]，根据Cys的数目及位置，OBPs分为Minus-OBPs、“Dimer”OBPs、非典型 OBPs(Atypical OBPs)、“Plus-C”OBPs和典型 OBPs (Classical OBPs)5种主要类型[13].结构分析表明，BtauOBP16和BtauOBP22氨基酸序列缺少第2和第5个Cys残基，属于Minus-OBPs[13]；BtauOBP24包含两个类似于典型 OBP 的6个保守的Cys结构，为“Dimer”OBPs；BtauOBP15与“Plus-C”OBPs的结构式Cys-X8-41-Cys-X3-Cys-X39-47Cys-X17-29-Cys4a-X9-Cys-X8-Cys-Pro-X9-11-Cys6a[14]或Cys-X20-41-Cys-X3-Cys-X41-46-Cys-X19-29-Cys4a-X9-Cys-X8-Cys-Pro-X9-10-Cys6a-X9-10[13,15]相吻合，为“Plus-C”OBPs；BtauOBP9虽包含 9个Cys，但与非典型 OBPs的结构式Cys-X26-27-Cys-X3-Cys-X36-38-Cys-X11-15-Cys-X8-Cys[13,16]不吻合，与黑腹果蝇中仅“Plus-C”OBPs中Cys5与Cys6之间被9个氨基酸残基隔开的特征吻合[15]，认为其为“Plus-C”OBPs；其余OBPs都包含6个Cys残基，且符合 Cys-X20-66-Cys-X3-Cys-X21-43-Cys-X8-14-Cys-X8-Cys,Cys-X15-39-Cys-X3-Cys-X21-44-Cys-X7-12-Cys-X8-Cys 或X22-68-Cys-X25-68-Cys-X3-Cys-X31-46-Cys-X8-29-Cys-X8-9-Cys-X5-71[15]的结构特点，为典型 OBPs，见图1所示.

表2 南亚实蝇气味结合蛋白基因与最匹配的瓜实蝇气味结合蛋白基因比较

图1 已克隆的南亚实蝇OBPs的序列比对图

2.2 南亚实蝇OBPs的同源性分析

通过与NCBI、公共数据库进行比对，成功克隆的南亚实蝇OBPs序列和瓜实蝇的OBPs序列表现出高度保守性，如表2所示：仅有3条OBPs的相似度低于95%，分别为BtauOBP2-a (93%),BtauOBP5(92%),BtauOBP15(89%).

2.3 南亚实蝇OBPs的进化分析

用MEGA5.0软件对这26条OBPs序列与黑腹果蝇D.melanogaster(58条)、瓜实蝇B.cucuribitae(34条)、地中海实蝇C.capitata(28条)、橘小实蝇B.dorsalis(47条)OBPs序列进行进化树构建，1 000次重复的结果表明：南亚实蝇OBPs序列中有16条与瓜实蝇OBPs聚类数值达90以上，说明南亚实蝇与瓜实蝇亲缘关系最近(图2).

●表示BtauOBPs；○表示DemlOBPs；▲表示BcucOBPs；图中分支点的数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度的百分比(%).图2 MEGA5.0构建的南亚实蝇与黑腹果蝇、地中海实蝇、橘小实蝇、瓜实蝇OBPs的系统发生关系

3 结论与讨论

伴随着高通量测序技术在昆虫上的应用[17-18]和转录组测序成本的降低，对昆虫OBPs的研究得到迅速发展.就实蝇而言，得益于黑腹果蝇D.melanogaster全基因测序[19-20]的完成及其51个嗅觉和味觉基因的报道[15]，在地中海实蝇[21]、苹果实蝇、美国核桃实蝇[22]、橘小实蝇[23-24]等实蝇种类上OBPs的研究都得到了较大进展，但对南亚实蝇这一中国危害较严重的4种实蝇(橘小实蝇B.dorsalis、瓜实蝇B.cucuribitae、南亚实蝇B.tau、柑橘大实蝇B.minax(Enderlein))中唯一对CUE、ME都有趋性反应的实蝇却缺乏相关研究.笔者首次从南亚实蝇转录组数据库中筛选出32条OBPs候选基因，并成功克隆验证出26条，这为下一步研究其OBPs的高级结构和功能提供了条件.同源性分析表明，南亚实蝇OBPs与瓜实蝇OBPs同源性很高，与南亚实蝇对瓜实蝇引诱剂CUE[8]和信息素[25]产生强烈行为反应的研究一致，此为下一步南亚实蝇、瓜实蝇引诱剂的改进提供了理论依据，但两种实蝇无论形态特征还是寄主谱等都差异很大，这说明要了解实蝇复杂的嗅觉机制只研究气味结合蛋白是远远不够的，也解释了为什么自CUE/ME后实蝇引诱剂没有实质性突破的原因.

昆虫气味结合蛋白(OBPs)是广泛分布于昆虫触角感器淋巴液中的一种低分子量的水溶性蛋白[12]，昆虫对寄主植物挥发物、信息素等化学信号的感受，主要通过其还原型与气味分子发生特异性结合，而将外界疏水性的气味分子运载到嗅觉神经树突膜上的感觉受体(olfactory receptor，简称OR)来实现[26].根据配体差异将OBPs分为GOBP/PBP,CRLBP(chemical-sense-related lipophilic-ligand-binding protein),ABPX(antennal-binding protein X)3类[13].从图2聚类分析可以看出，BtauOBP3,BtauOBP10,BtauOBP13,BtauOBP20与CRLBP亚类的DemlOBP19d,DemlOBP28a[15]聚在一起，属于CRLBP亚类；BtauOBP23,BtauOBP2-a,BtauOBP26与ABPX亚类的DemlOBP83a,DemlOBP83b[15]聚在了一起，属于ABPX亚类.BtauOBP9在进化分析中与黑腹果蝇中具有“Plus-C”结构的DemlOBP84a聚在一起，这与结构分析结果一致；同时，结构差异很大的BtauOBP8也与黑腹果蝇中具有“Plus-C”结构的DemlOBP84a聚在一起，说明要全面了解BtauOBPs的功能必须对其结构进行深入研究，这也是笔者后续要研究的内容.