基于mt DNA COⅠ设计种特异性引物快速鉴定具条实蝇

黄 振，郭琼霞，陈韶萍，3

(1.福州长乐机场海关，福建 福州 350209； 2.福州海关检验检疫技术中心福建 福州 350001； 3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

具条实蝇(Bactrocerascutellata(Hendel))为国际上主要检疫性害虫，也是我国进境植物检疫性有害生物。具条实蝇隶属实蝇科(Tephritidae)果实蝇属(Bactrocera)[1]。近年来，随着全球气候变暖和果蔬进口的批量增多以及国内果蔬的贸易流通，具条实蝇在我国发生为害的潜在危险性不断增加，一旦传入发生，不仅会严重危害果蔬生产，造成直接的经济损失，还将影响我国果蔬的对外贸易和国际声誉，产生许多不利影响[2]。具条实蝇的形态与其同属的近缘种极其相似，而且现行进境的水果中截获到的均为卵、幼虫和蛹，需通过饲养为成虫后再行鉴定，如此，加上饲养周期、饲养条件和虫态等因素的限制，在口岸短时间里无法做到快速鉴定，也势必影响进境果蔬快速通关，因此开展关于实蝇的快速鉴定识别的技术研究迫在眉睫。具条实蝇主要分布在越南[3]、印度[4]、缅甸[5]、老挝[6]、日本[7-8]及韩国[9]；我国在广东、福建、广西、浙江、江西、海南、四川、贵州、云南、湖北、陕西和台湾等地区也有发现[4，7]。具条实蝇主要危害茄科植物、瓜类和芒果等具有经济价值的果蔬，近年来，具条实绳在我国的分布范围急剧扩大，对我国经济造成很大影响，在我国的部分地区如安徽、陕西、河南等，具条实蝇危害果蔬已上升为主要的实蝇类的害虫之一[10-12]。

本文基于种特异引物PCR-SS-PCR技术，研究了一种采用设计目标物种特异性引物的快速鉴定方法，能够快速、准确鉴定截获的实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫等不同虫态，甚至残体等，解决传统形态学分类方法难以解决的问题[13-14]，并在口岸检疫截获中得到验证和应用，为实蝇的疫情监测和口岸果蔬的快速通关提供参考。

1 供试虫样

本试验供试的实蝇种类有：具条实蝇、瓜实蝇(B.cucurbitae(Coquillett))、黑颜实蝇(B.diaphora(Coquillett))、颜带实蝇(B.cilifer(Hendel))、何氏华实蝇(B.hochii(Zia))、锈实蝇(B.rubigina(Wang & Zhao))、番石榴实蝇(B.correcta(Bezzi))、杨桃实蝇(B.carambolaeDrew & Hancock)、桔小实蝇(B.dorsalis(Hendel))、瘤胫实蝇(B.tuberculata(Bezzi))、辣椒实蝇(B.latifrons(Hendel))、南瓜实蝇(B.tau(Walker))、黑膝实蝇(B.scutellaris(Bezzi))、近黑颜实蝇(B.parater(Zhao & Lin))、瑞丽果实蝇(B.ruiliensis(Wang，Long et Zhang))、滇寡鬃实蝇(B.modica(Hardy))、五指山实蝇(B.wuzhishana(Lin et Yang))、瓜棍腹实蝇(Dacuslongicornis(Wiedemann))、枣实蝇(Carpomyavesuviana(Costa))和腿端黑实蝇(B.atrifemur(Drew & Hancock))等20种实蝇，以上均隶属于《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名单》之中的检疫性有害生物。虫样来自口岸截获和边境监测。

2 试验方法

2.1 DNA提取和质量检测

2.1.1 DNA提取 本试验采用试剂盒法(E.Z.N.A.TM Insect DNA Kit)提取基因组DNA[15]。

2.1.2 DNA质量检测 利用上游LCO 1 490(序列为5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’)和下游HCO 2 198(序列为为5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)1对通用引物对供试的20实蝇虫样提取的DNA模板质量进行检测。具体步骤为将实蝇或是身体部分(如翅或足)或是幼虫、蛹放置于2 mL的离心管中，加入一定量的液氮研磨后，按照试剂盒说明书的指南进行操作，再将提取得到的基因组DNA模板样品置于冰箱(-20 ℃)备用，PCR反应在定量梯度PCR仪上进行。

2.2 引物设计

通过数据库(NCBI)查找具条实蝇已公布登录的序列与已知其它种类的实蝇序列进行比对，选定登录号为KF660107的基因序列(mt DNA COⅠ)，应用BLAST程序检查与数据库中提供的同源序列，确定设计具条实蝇特异性引物的实蝇种类和登录号为：具条实蝇B.scutellataKF660107.1、普通果实蝇B.caudateGQ154089.1、瓜实蝇B.cucurbitaeGQ154098.1、黑膝实蝇B.scutellarisKF660082.1、锈实蝇B.rubiginaKF659744.1、南瓜实蝇B.tauKF660144.1、五指山实蝇B.wuzhishanaKM024416.1、辣椒实蝇B.latifronsKJ753915.1等8种实蝇，下载8种实蝇登录号对应序列的FASTA格式，利用数据库(NCBI)中的Primer-Premier 5.0、Oligo 6.44，分别进行人工设计引物、引物评定，并进行ClustalW多重比对，筛选出种特异性引物JF’190和JR’386，再利用NCBI数据库，将设计的JF’190和JR’386引物，通过Primer-BLAST程序，进行同源序列检查，最终将正向引物JF’190的第1、16个碱基T转换成C，第3、7、20个碱基A转换成G，确定出引物JF190和JR386。

2.3 引物种特异性测试

对筛选确定的引物JF190和JR386进行种特异性测试，其步骤为：选用具条实蝇为阳性对照，其余的19种实蝇虫样作为阴性对照，设计本试验的反应体系和反应条件，采用凝胶成像分析仪分析筛选确定的引物是否能扩增出预期大小的目标片段，测试验证本试验所设计引物的种特异性。

2.4 引物灵敏度的测试

选取不同虫态的具条实蝇虫样提取基因组DNA，将其DNA模板浓度按10-1、10-2、10-3倍3种梯度稀释，再采用核酸蛋白分析仪检测种特异性引物JF190和JR386的灵敏度。

2.5 应用与验证

采用口岸进口截获的实蝇(幼虫已饲养到成虫，并经专家鉴定复核，确认为具条实蝇)的幼虫、卵、蛹以及成虫的不同虫态和成虫的部分腿、翅膀等虫体组织作为虫样，提取基因组的DNA，用具条实蝇的种特异性引物JF190和JR386，应用SS-PCR技术方法进行PCR扩增检测，验证该技术方法和种特异性引物的稳定性与准确性。

3 结果与分析

3.1 DNA质量检测结果

本实验选用整只实蝇的蛹、幼虫、成虫，或是实蝇的一条腿，或是一片翅膀，作为实验材料，根据试剂盒的说明书操作步骤进行提取，将得到基因组DNA，利用通用引物LCO1490和HC02198进行PCR扩增，结果是供试的20种实蝇的基因组DNA，均能在长度约700 bp的位置扩增出一条清晰透明的条带(图1)。

横线部分为种特异性引物JF’190和JR’386的序列位置图1 8种果实蝇的ClustalW多重比对的部分结果图

3.2 引物的选择

利用Bioedit对已下载的KF660107.1、KF660082.1、KM024416.1、GQ154089.1、KF660144.1、GQ154098.1、KJ753915.1和KF659744.1等8种实蝇序列，采用ClustalW多重比对方法，筛选出种特异性引物JF’190为5’-TAATTGATTAGTACCTTTAATACTCGG-3’；JR’386为5’-GATCAACAGATGCTCCTCCATGGG-3’(图2)。种特异性引物JF190和JR386由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

M为50 bp DNA Ladder，1为具条实蝇，2为锈实蝇，3为番石榴实蝇，4为桔小实蝇，5为瑞丽果实蝇，6为杨桃实蝇，7为瘤胫实蝇，8为瓜实蝇，9为南瓜实蝇，10为辣椒实蝇，11为颜带实蝇、12为近黑颜实蝇，13为滇寡鬃实蝇，14为黑膝实蝇，15为何氏华实蝇，16为瓜棍腹实蝇，17为枣实蝇，18为腿端黑实蝇，19为五指山实蝇，20为黑颜实蝇，21为空白对照图2 对20种实蝇提取的DNA模板采用通用型引物LCO1490和HCO2198进行质量检测的结果

3.3 引物种特异性

将具条实蝇作为阳性对照，其余19种供试实蝇作为阴性对照，结果显示仅具条实蝇在约197 bp位置扩增出一条单一的清晰透明的条带外，其余的19种阴性实蝇样本均未发现任何的条带。引物的种特异性试验重复3次，所得结果一致(图3)，表明该种特异性引物JF190和JR386的特异性和稳定性强。

将所获得的PCR产物进行测序(由上海英潍捷基贸易有限公司)，利用NCBI数据库，将得到的序列进行BLAST，其结果与数据库中的具条实蝇序列完全一致。

(M为100 bp DNA Ladder，1为具条实蝇，2为颜带实蝇，3为锈实蝇，4为番石榴实蝇，5为桔小实蝇，6为瑞丽果实蝇，7为杨桃实蝇，8为瘤胫实蝇，9为瓜实蝇，10为南瓜实蝇，11为辣椒实蝇，12为滇寡鬃实蝇，13为黑膝实蝇，14为近黑颜实蝇，15为腿端黑实蝇，16为何氏华实蝇，17为瓜棍腹实蝇，18为五指山实蝇，19为黑颜实蝇，20为枣实蝇，21为空白对照图3 引物JF190和JR386的种特异性验证

M为100 bp DNA Ladder，1为10°倍，2为10-1倍，3为10-2倍，4为10-3倍，5为空白对照 图4 引物JF190和JR386的灵敏度验证

3.4 引物的灵敏度

采用核酸蛋白分析仪检测已提取的具条实蝇DNA模板，质量浓度为28.89 ng·μL-1。取3种梯度的DNA模板测定最低阈值浓度，结果是随着模板浓度逐渐降低，所扩增出的条带逐渐变淡，在稀释10-3倍后，条带还仍可发现(图4)。说明该方法所获取的种特异性引物具有较高的灵敏度。

3.5 应用与验证

将本实验方法应用于具条实蝇的实际鉴定工作中。将进口水果中截获的印度、日本、老挝、泰国等不同国家的具条实蝇(经专家鉴定复核)的虫样共20份，其中包括不同虫态的具条实蝇虫样，再将瓜实蝇、南瓜实蝇等作为阴性对照，共22份，应用种特异性引物进行验证。结果表明为具条实蝇的20份样本，均发现有目标条带，而对照则没有，说明SS-PCR技术方法鉴定结果不仅能快速准确，而且具有较好的稳定性，可以应用于具条实蝇的实际鉴定工作(图5)。

4 讨论

4.1 SS-PCR检测鉴定方法灵敏度高

目前，以分子生物学技术进行检疫性害虫的鉴定研究在开展与应用中，在对具条实蝇的分子鉴定方面，Mun等[9]利用ApaI，NheI和SacI等限制性内切酶，鉴别具条、桔小、南瓜以及地中海等4种实蝇；吴佳教等[17]应用PCR-RFLP技术对常见的具条、桔小等9种实蝇开展研究。张红梅等[18]针对陕西省常见的4种实蝇，采用RAPD技术对其基因组DNA进行多态性研究。而本实验主要是选用mt DNA COI基因的 DNA条形编码技术，采用mt DNA COⅠ作为标记基因，设计种特异性引物进行鉴定。因为mt DNA COⅠ基因进化速率比核DNA快，很少存在插入和缺失，保守性较强，易被通用引物扩增，不同物种之间又存在足够的变异能够将其分开，所以选用mt DNA COⅠ作为标记基因建立的SS-PCR方法，检测到的DNA模板浓度可低至2.889×10-4ng·μL-1，设计的特异性引物具有较强的特异性和较高的灵敏度，适用于种间鉴别[19]。

M为100 bp DNA Ladder，1～5为印度具条实蝇，6～10为日本具条实蝇，11～15为泰国具条实蝇，16～20为老挝具条实蝇，21为南瓜实蝇，22为瓜实蝇，23为空白对照图5 应用种特异性引物SS-PCR技术快速鉴定具条实蝇的验证

4.2 建立的SS-PCR方法可满足口岸快速鉴定的需求

本实验选用具条实蝇作为阳性对照，其它20个种类实蝇作为阴性对照，利用本实验设计的特异引物，采用从印度、日本、泰国、老挝进境的水果中截获的具条实蝇及其瓜实蝇和南瓜实蝇等进行混合实验，仅具条实蝇成虫的不同部分的组织和不同虫态共20个样品，能特异性并稳定性地扩增出长度约197 bp的清晰且单一的目标条带，因此，建立SS-PCR方法，具有很强的特异性，能特异快速鉴定出具条实蝇。本方法在应用于口岸果蔬进境截获到具条实蝇的鉴定中，将其幼虫进行饲养，用不同虫态进行检测验证，结果与形态鉴定结果一致；同时进一步验证了本实验所设计引物的特异性。此外，本方法操作简便快捷，鉴定快速准确，可应用于实际检疫工作，解决了口岸快速鉴定的需求，并具有较好的应用价值。