大鼠中心静脉导管相关性血栓模型的建立方法▲

甘 晓 应燕萍 韦 艳 赵慧函 蒋庆娟 文 萃

(广西医科大学第一附属医院护理部,南宁市 530021,电子邮箱：ganxiao0722@126.com)

中心静脉血管通路装置(central venous access device,CVAD)也称中心静脉导管,是一种经皮置入体内且末端位于上腔或下腔静脉的装置,主要用于化疗、输入血液制品、胃肠外营养及其他疗法，或者血流动力学监测[1-2]。CVAD的优越性使得其在临床上得到广泛应用，在美国，每年有超过500万个CVAD被用于临床[3]。但CVAD可引起许多导管相关并发症，其中导管相关性血栓(catheter-related thrombosis,CRT)是最常见且最严重的并发症之一。有研究显示CRT发生率为13.8%，其中近90%的CRT为无症状血栓[4]。目前有关CRT的临床研究很多，但相关的基础研究较少，CRT的发生机制尚不明确。本研究通过经颈外静脉留置CVAD的方法建立大鼠CRT模型，为CRT的基础研究提供模型参考，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：无特定病原体级SD大鼠58只，雄性，体重170～220 g，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002。大鼠饲养于室温为(24±2) ℃，相对湿度为40%～60%的无特定病原体级实验室中，自由饮水、摄食。

1.1.2 主要试剂与仪器：水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂，批号：20180514)，10%中性福尔马林固定液(广州维格斯生物科技有限公司，生产批号：18101201)，颈静脉导管及接头(思科诺生物科技北京有限公司，1#)，切片机(德国Leica公司，型号：RM2245)，正置荧光显微镜(日本Olympus公司，型号BX53 )

1.2 方法

1.2.1 动物分组：将58只雄性SD大鼠随机(计算机法)分为对照组(n=3)、假手术组(n=15)和模型组(n=40)。将假手术组和模型组再随机(计算机法)平均分为建模后1、4、7、10、14 d组。

1.2.2 CRT模型的建立：参考Terry等[5]提出的手术方法进行置管。模型组采用10%水合氯醛经腹腔注射进行麻醉，右侧颈部备皮，常规消毒、铺巾，沿气管右侧0.5 cm纵切颈部1.5 cm，钝性游离右颈外静脉长约1 cm。用3-0丝线结扎游离静脉的远心端，于结扎点下将静脉剪一切口，从静脉切口将导管往上腔静脉方向插入2.5 cm，回抽见回血后经导管输入1 mL生理盐水封管，3-0丝线分别固定导管突起部上、下端，防止导管脱出或深入血管，见图1。将导管头端埋于颈部皮下组织，缝合皮肤，结束手术。假手术组按模型组麻醉大鼠后切开颈部，钝性分离暴露右颈外静脉后立即缝合颈部皮肤。对照组不做任何处理，正常饲养。

1.2.3 CRT的评估：假手术组及模型组在建模后相应时间点进行解剖取材，对照组在同期饲养的最后一天解剖取材，各组均取同侧静脉组织。大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，解剖颈部取右颈外静脉至上腔静脉的组织(模型组需拔出静脉导管后取材)，置于10%中性福尔马林中固定48 h，脱水经石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色法染色，在显微镜下观察置管静脉的形态学变化。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料以例数(百分比)表示。

2 结 果

2.1 一般情况 58只SD大鼠中，模型组有1只大鼠因建模时麻醉过量死亡(建模7 d组)，其余57只大鼠均存活。大鼠置管成功率100.0%(39/39)，导管留置期间无导管脱出。

2.2 CRT形成情况 对照组和假手术组在实验期间均未见血栓形成；模型组32只大鼠发生CRT，CRT发生率为82.1%(32/39)，其中建模后1 d组、建模后4 d组和建模后7 d组分别有6只、5只、5只大鼠发生血栓，血栓发生率为75.0%(6/8)、62.5%(5/8)和71.4%(5/7)，建模后10 d和14 d组大鼠均发生血栓，血栓发生率为100.0%(8/8)。

2.3 各组大鼠右颈外静脉组织病理学结果 显微镜下可见对照组和假手术组右颈外静脉内皮结构光滑、完整，管腔无血栓形成(图 2A、图 2B)。显微镜下可见模型组右颈外静脉有CRT形成(图2C)；建模后1 d、4 d和7 d时主要为混合血栓，血管腔有淡粉色无结构血小板小梁，小梁间充满红细胞、白细胞；建模后10 d和14 d时主要为血栓机化血管内皮细胞和成纤维细胞及炎症细胞形成肉芽组织并开始长入血栓内。

图1 右颈外静脉置入导管过程

注：A为颈部消毒铺巾；B为暴露右颈外静脉；C为右颈外静脉下方穿过两条3-0丝线；D为导管插入右颈外静脉；E为导管固定结束。

图2 各组大鼠颈外静脉组织病理学变化(苏木精-伊红染色，20)

注：A为对照组；B为假手术组；C模型组(为血栓；▲为肉芽)。

3 讨 论

CRT是指由于穿刺或导管直接损伤血管内膜，以及患者自身状态等多因素作用，使导管所在的血管内壁及导管附壁形成血凝块，导致导管部分或完全堵塞，伴或不伴临床症状[6-7]。临床上CRT患者大多数无症状，在因置管发生血栓的患者中，超过90%的患者通过超声检查才发现有血栓形成[8]。CRT的主要症状有手臂发红、肿胀或疼痛，颈、臂、胸可见静脉扩张等[9]。CRT可引起肺栓塞、再发性深静脉血栓、血栓后综合征等并发症，其中肺栓塞和深静脉血栓统称为静脉血栓栓塞，静脉血栓栓塞的高发生率和病死率使其成为全球疾病的主要负担[10]。CRT不仅会导致患者治疗的中断，增加患者住院时间和医疗费用，还会影响患者预后，增加病死率，加重社会医疗负担[11]。早期诊断及有效预防CRT对改善患者的疗效及预后有积极的意义。

CRT的发生涉及多因素和多系统，传统观点认为，血管内皮损伤、血流速度减慢、血液高凝状态的共同作用促使血栓的形成。本研究通过手术暴露大鼠右侧颈外静脉，从静脉置入导管并留置于血管内制作CRT大鼠模型。导管置入后内皮细胞受损，内皮下胶原暴露引起血小板黏附聚集，激活凝血因子Ⅻ，损伤的内皮释放组织因子，激活凝血因子Ⅶ，启动了内、外源性凝血过程[12]。静脉管腔内导管的置入使血液流通空间变窄，血流速度减慢，当血流缓慢或有旋涡时血小板进入边流，极大增加了与内膜接触的机会以及黏附内膜的可能性，有利于血栓的形成。本研究结果显示，建模后7 d时血栓发生率为71.4%，建模后10 d、14 d血栓发生率均为100%，提示该建模方法CRT成功率高，且导管留置10 d以后CRT的发生率最高，笔者认为血栓的形成可能与导管留置的时间有关。本研究中，大鼠置管1 d即可发现有血栓形成，置管1周内，置管的静脉腔内形成许多血小板梁，其间纤维蛋白网罗大量红细胞及部分白细胞，从而形成血小板梁与红细胞交替的混合血栓；建模后10 d和14 d时，肉芽组织开始深入血栓组织，逐渐代替血栓，血栓开始机化。血栓形成后会发生机化、钙化等现象，但本研究未在显微镜下观察到血栓钙化，可能与导管留置时间较短有关。

有关CRT动物模型建立的研究报告多以兔子为实验动物，如邓婷[13]通过兔颈外静脉留置静脉留置针的方法构建CRT模型，观察不同留置时间CRT的发生情况及置管周围组织的病理变化，在显微镜下观察到静脉腔内有不同程度的血栓。艾熙等[14]于家兔右颈外静脉插入CVAD建立CRT模型，在置管第7天15只家兔全部发生CRT。但兔子体积较大，需单笼饲养，经济消耗大。本研究采用大鼠作为模型具有动物体积小、可操作性高、可重复性强，价格低廉、适合开展大样本量研究的优点。大鼠的颈外静脉较家兔细，静脉被刺激后会收缩甚至痉挛，导致颈外静脉置入CVAD难度较大。但本研究中大鼠CVAD的置管成功率为100%(39/39)，提示用大鼠建立CRT模型可行性高。然而本研究尚未通过导管对大鼠进行输液治疗，未能说明药物对CRT的形成是否有促进作用，今后将深入研究。

综上所述，经右颈外静脉留置CVAD可以成功建立大鼠CRT模型，且该模型形成的血栓稳定，血栓病理符合人体血栓的结构特点，可为今后深入研究CRT及导管相关疾病提供模型参考。