突发性耳聋患者血清T淋巴细胞亚群和Th1/Th2相关细胞因子水平及其临床意义▲

臧 雯 周鲲鹏 张学梅

(河北省石家庄市第一医院耳鼻咽喉科，石家庄市 050011，电子邮箱：zangwen3317@163.com)

突发性耳聋是临床耳科常见的急症疾病之一，表现为不明原因下突然出现的感音神经性听力下降，治疗不及时易造成永久性听力丧失，严重影响患者生活质量[1]。突发性耳聋常伴发耳鸣、眩晕等症状，多为单侧发病，双侧发病较为少见，高发于40岁左右人群，无性别差异，儿童较少见[2]。有研究表明，突发性耳聋的发生与病毒感染、机体免疫功能相关，而Th细胞在免疫反应中发挥重要作用，其中Th1/Th2及其分泌的细胞因子能减少或清除机体病原菌，维持机体处于免疫动态平衡状态，此平衡一旦遭到破坏可导致机体发生一系列病理变化[3-4]。但目前关于突发性耳聋患者Th1/Th2细胞因子平衡状态的研究较少。因此，本研究探讨突发性耳聋患者T淋巴细胞亚群和Th1/Th2相关细胞因子水平及其临床意义，为突发性耳聋的诊断和治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年8月至2019年1月我院收治的60例突发性耳聋患者作为研究对象(研究组)。纳入标准：(1)符合突发性耳聋的诊断标准[5]；(2)首次发病。排除标准：(1)先天性听力低下者；(2)有耳膜手术史者；(3)近3个月内有免疫增强剂或抑制剂使用史者；(4)近3个月内有激素使用史者；(5)合并自身免疫缺陷性疾病者；(6)合并严重肝、肾等功能代谢障碍者；(7)恶性肿瘤患者；(8)妊娠或哺乳期女性。研究组中男性27例、女性33例，年龄25～58(44.16±4.30)岁，病程2～45(13.37±2.86) d；听力下降程度：中度耳聋17例，重度耳聋23例，极重度耳聋20例。另选取同期行体检的健康者60例作为对照组，排除标准同研究组，其中男性29例、女性31例，年龄27～60(45.52±4.24)岁。研究组和对照组的性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，有可比性。中度耳聋患者中男性9例、女性8例，年龄27～55(44.71±3.65)岁，病程3～43(12.92±2.61) d；重度耳聋患者中男性10例、女性13例，年龄25～58(44.38±4.68)岁，病程2～42(13.75±3.12) d；极重度耳聋患者中男性8例、女性12例，年龄25～57(43.82±3.82)岁，病程7～45(13.24±2.31) d。中度、重度、极重度耳聋患者的性别、年龄、病程比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，有可比性。本研究经石家庄市第一医院伦理委员会审查批准，所有研究对象对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 样本采集 观察组患者于入院后，对照组研究对象于体检当日，采集空腹静脉血3 mL，置于离心管中，室温静止25 min，于4℃下2 800 r/min离心10 min，取上清，-80℃冻存用于待检细胞因子；另取2 mL血浆于抗凝管中，用于检测T淋巴细胞亚群。

1.3 检测方法

1.3.1 T淋巴细胞亚群检测：采用流式细胞术检测T细胞亚群。CD3、CD4、CD8抗体购自瑞士罗氏公司(批号：CCM030)，流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司(CytoFLEX S型)。取待测血浆100 μL，加入藻红蛋白-花青苷5/异硫氰酸荧光素/藻红蛋白三色标记单克隆抗体20 μL，37℃ 避光孵育15 min，加红细胞溶解液(美国Beckman Coulter公司，批号：A09777)1 mL溶解10 min，4 ℃下以2 000 r/min离心5 min，弃上清，磷酸盐缓冲液洗3次，5 min/次，样品上流式细胞仪直接检测。

1.3.2 Th1/Th2相关细胞因子的检测：采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中白细胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-10、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司(批号：180616、180319、180223、180311)。(1)加样。设置待检样品孔、标准品孔及空白孔，用磷酸盐缓冲液将标准品稀释为1.25、2.5、5、10、20、40 pg/mL浓度，分别取50 μL加入标准孔，在样品孔直接加入50 μL待测样品，于振荡器上混匀，室温孵育60 min。(2)洗板。弃液，磷酸盐缓冲液重复清洗3～4次，30 s/次，吸水纸上拍干。(3)加一抗。各孔加一抗即用工作液，分别为生物素标记的抗IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α抗体(空白孔不加)，于振荡器上混匀，37℃孵育30 min；弃液，磷酸盐缓冲液重复清洗3～4次，30 s/次，吸水纸上拍干。(4)加二抗。每孔加50 μL酶标二抗工作液(辣根过氧化物酶标记的亲和链霉素)，于振荡器上混匀，37℃孵育15 min；弃液，磷酸盐缓冲液重复清洗3～4次，30 s/次，吸水纸上拍干。(5)加底物。每孔加底物工作液3,3′,5,5′-四甲基联苯胺100 μL，37℃避光孵育10 min。(6)终止反应。各孔加终止液50 μL终止反应，采用酶标仪检测(赛默飞公司，型号：Multiskan FC型)，在450 nm处检测吸光度，计算IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α浓度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用t检验；计数资料用例数或百分比表示，比较采用χ2检验；采用Pearson检验进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组外周血T淋巴细胞亚群水平比较 研究组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平低于对照组(均P<0.05)，但两组CD4+/CD8+比值差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组外周血T淋巴细胞亚群水平比较(x±s)

2.2 两组血清Th1/Th2相关细胞因子水平比较 研究组血清IL-4、IL-10水平低于对照组，IL-2水平高于对照组(均P<0.05)，但两组TNF-α水平差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 两组受试者血清IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平比较(x±s，pg/mL)

2.3 两组血清Th1/Th2相关细胞因子平衡状态比较 研究组IL-2/IL-4、TNF-α/IL-4比值高于对照组(均P<0.05)，但两组IL-2/IL-10、TNF-α/IL-10比值差异无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

表3 两组受试者血清Th1/Th2细胞因子平衡状态(x±s)

2.4 突发性耳聋患者血清Th1/Th2相关细胞因子之间的相关性 突发性耳聋患者血清IL-2、TNF-α水平与IL-4无明显相关性(均P>0.05)，与IL-10呈负相关性(均P<0.05)，见表4。

表4 突发性耳聋血清IL-2、TNF-α与IL-4、IL-10相关性

2.5 突发性耳聋患者血清Th1/Th2相关细胞因子表达与听力下降程度的关系 中度耳聋、重度耳聋、极重度耳聋患者IL-4、IL-10、TNF-α水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。其中，极重度耳聋患者血清IL-4水平低于重度耳聋患者，IL-10低于中度耳聋患者，TNF-α水平高于中度及重度耳聋患者(均P<0.05)。见表5。

表5 不同程度突发性耳聋患者血清Th1/Th2相关细胞因子水平及比值比较(x±s)

组别nIL-2/IL-4比值IL-2/IL-10比值TNF-α/IL-4比值TNF-α/IL-10比值中度耳聋171.64±0.321.18±0.264.81±0.653.45±0.74重度耳聋231.69±0.351.23±0.315.09±0.853.78±0.72极重度耳聋201.67±0.291.13±0.285.26±0.743.95±0.65 F值0.1180.6521.6212.373P值0.8890.5250.2070.102

注：与中度耳聋比较，*P<0.05；与重度耳聋比较，#P<0.05。

3 讨 论

突发性耳聋可使患者的听力在短时间内降到最低点，因发病部位在内耳，不可活检，大多患者病因不明确。突发性耳聋患者除颅内听神经外，无其他颅神经损害症状，主要根据其内耳功能障碍病理机制进行治疗，包括使用类固醇激素、抗氧化剂、抗凝剂等药物以及高压氧治疗等，但治疗效果个体差异较大，且疗效与病程长短密切相关[6]。因此，寻找早期诊断手段及治疗新方法对改善突发性耳聋预后极其重要。

过去内耳被认为是“免疫豁免”器官，但近年来已有研究表明内耳并非“免疫豁免”器官，内淋巴囊为其免疫应答中心，内耳受到病原刺激时，可明显增加内淋巴囊外免疫活性细胞数量，能与机体巨噬细胞、T细胞及其亚群相互作用参与内耳免疫应答，而突发性耳聋的发生与免疫介导异常密切相关[7]。本研究结果显示，研究组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平低于对照组(P<0.05)，但两组CD4+/CD8+比值差异无统计学意义(P>0.05)，与Lee等[8]的研究结果相似，提示细胞免疫参与突发性耳聋的发病。

Th1/Th2属于CD4+T淋巴细胞亚群，正常情况下，Th1/Th2之间相互调节、相互制约从而维持动态平衡状态，是保障机体正常免疫功能的基础，两者比例一旦失衡将引起免疫功能紊乱，导致疾病发生[9]。Th1主要分泌IL-2、TNF-α等细胞因子，正常机体内IL-2能促进Th0分化成Th1，抑制Th2相关细胞因子分泌；Th2主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，能促进Th0分化成Th2[10]。Th1/Th2平衡失调与多种疾病发生、发展相关，如施林林等[11]发现老年性皮肤瘙痒症患者Th1细胞功能亢进，Th2细胞功能衰退，这种功能改变与疾病严重程度相关，纠正Th1/Th2失衡可达到治疗目的。本研究结果显示，研究组血清IL-4、IL-10水平低于对照组，IL-2水平高于对照组(P<0.05)，但两组TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)，与衡伟伟等[12]的研究结果相似，这提示突发性耳聋患者Th1功能亢进，Th1相关细胞因子处于细胞免疫主导地位。此外，研究组IL-2/IL-4、TNF-α/IL-4比值高于对照组(P<0.05)，但两组IL-2/IL-10、TNF-α/IL-10比值差异无统计学意义(P>0.05)，这进一步提示突发性耳聋患者存在Th1/Th2失衡，且Th1占主导地位。IL-2、TNF-α为促炎因子，能趋化炎性细胞积聚于受累组织，释放大量活性物质，加重局部炎症反应，导致局部损伤；而IL-4、IL-10为抑炎因子，当机体受到细菌感染时IL-10分泌量增加，抑制IL-2、TNF-α分泌，以增强对机体的免疫保护[13-14]。在突发性耳聋中，IL-2、TNF-α分泌增加使Th2细胞分化减少，抑炎因子分泌量减少，出现Th1/Th2细胞失衡，并向Th1漂移。相关性分析显示，突发性耳聋血清IL-2、TNF-α水平与IL-4无明显相关性(P>0.05)，与IL-10呈负相关性(P<0.05)，提示IL-2、TNF-α与IL-10可能通过相互拮抗作用参与突发性耳聋的发生、发展。

极重度耳聋患者血清IL-4水平低于重度耳聋患者，IL-10低于中度耳聋患者，TNF-α水平高于中度、重度耳聋患者(均P<0.05)，提示Th1/Th2平衡失调可能与突发性耳聋听力下降程度有关，临床治疗时加强免疫系统治疗可能会取得较好的治疗效果。有研究表明TNF-α能对糖皮质激素受体发挥抑制作用，当TNF-α处于高水平时糖皮质激素类药物治疗效果不佳，这可能也是难治性突发性耳聋治疗效果不理想的原因之一[15-16]。而其他Th1/Th2相关细胞因子是否也具有类似作用还未见报道，需进一步研究。

综上所述，突发性耳聋患者存在外周血Th1/Th2平衡失调，以Th1细胞免疫为主；Th1/Th2平衡失调可能还与患者听力下降程度有关。因此，在突发性耳聋患者治疗过程中应注意维持Th1/Th2免疫平衡。